Toll樣受體4與陰道微生態的相關性研究進展

宋悅筱 劉 樓 許涵潔 陳佳樂 陳 鈺 陸牡丹 陳道楨

Toll樣受體(Toll Like Receptor,TLR)是一種模式識別受體(pattern recognition receptor , PRR)，微生物及其代謝產物入侵人體是通過識別PRR，激活固有免疫從而激活抗原特異性獲得性免疫系統。TLRs是一個膜受體家族，在感知包括細菌、真菌和病毒在內的多種入侵病原體方面發揮著關鍵作用。TLR4是人類發現的第一個TLR，是介導信號轉導的重要PRR，而且是唯一可以經髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88 , MyD88)依賴型和β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)依賴型兩條信號通路的TLR家族成員。TLR4具有多種不同結構的配體，如植物二萜紫杉醇、呼吸道合胞病毒的融合蛋白、纖連蛋白和熱休克蛋白，其中最重要的配體是脂多糖。脂多糖是革蘭陰性菌外膜的重要成分，有強大的免疫刺激活性，TLR4通過識別脂多糖激活下游信號通路，在機體的細菌感染和免疫反應中起著重要作用。

TLR4介導的炎癥與免疫反應在女性生殖系統相關疾病中起著重要作用，而陰道微生態全程參與了女性生殖系統相關疾病的發生、發展。女性陰道微生態群落可以分為5組，其中4組以乳桿菌、卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌為主，而第5組的乳桿菌比例較低，嚴格厭氧菌比例較高。陰道微生態中最常見的菌群是乳桿菌。乳桿菌主要是通過產生乳酸來維持陰道的微生態平衡，從而發揮抑制炎癥的作用，除了乳桿菌外，陰道中的其他菌群也可能引起免疫反應，甚至會降解宿主粘膜，導致宿主更易感染。本文從TLR4的結構與功能、TLR4介導的信號通路及TLR4與陰道微生態的關系3個方面對TLR4做一綜述。

1 TLR4的結構與功能

1.1 TLR4的結構 TLR4是跨膜蛋白，其結構分為3部分，分別是含大量亮氨酸重復序列的胞外區、跨膜區，以及與銜接蛋白相互作用的胞質區。這個與銜接蛋白相互作用的胞質區即為TIR(Toll/interleukin-1 receptor domain , TIR)結構域，激活后TIR作為一個支架來募集銜接蛋白。銜接蛋白MyD88、MyD88連接蛋白(MyD88-adaptor like, Mal)、TRIF、TRIF相關的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)和SARM蛋白同樣有TIR結構域，通過同源性TIR結構域，銜接蛋白可以與TLR相互作用，激活其下游一系列信號通路。

1.2 TLR4的功能 TLR4最重要的功能之一是其可以識別革蘭陰性菌脂多糖，激活免疫反應，在炎癥反應和腫瘤微環境中起著重要作用。研究發現，雖然不同TLR的連接靶點不同，但不同TLR可以共享信號通路，誘導固有免疫反應。TLR識別配體和信號轉導依賴于從胞膜、胞質到胞核的許多分子，這些分子可以通過交叉調節、蛋白質修飾、輔助輔因子等調節TLR的反應。TLR4是第一個被發現的TLR家族成員，早在1998年Beutler等發現哺乳動物TLR4蛋白可識別脂多糖，并可能通過質膜傳遞脂多糖信號，同時也發現TLR4基因突變可導致革蘭陰性菌膿毒癥，破壞免疫功能。一項在雞的陰道細胞中的研究發現，TLR4還可以識別陰道細胞表達的促炎細胞因子和趨化因子。

2 TLR4介導的信號通路

TLR的信號通路涉及5種銜接蛋白，即MyD88、MAL、TRIF、TRAM和SARM，介導一系列的信號傳導。TLR4信號通路在整個TLR介導的信號通路中占有重要地位。TLR4是介導信號轉導的重要PRR，而且是唯一可以經MyD88依賴型和TRIF依賴型兩條信號通路的TLR家族成員。

TLR4的MyD88依賴的信號通路是TLR4經典的信號通路，在識別細菌脂多糖方面非常重要。TLR4除了MyD88依賴的經典信號通路之外，還有涉及銜接子如MAL、TRIF、TRAM和SARM的非MyD88依賴的信號通路。TLR4介導的信號通路錯綜復雜，多條通路級聯交叉，最終導致炎癥及其他反應。了解TLR4介導的信號通路機制對于開發靶向藥物，治療炎性疾病以及改善腫瘤的炎性微環境有很重要的意義。

3 TLR4與陰道微生態的關系

3.1 陰道微生態的概念及其臨床意義 女性的陰道微生態不僅僅指陰道菌群，而是一個整體的概念。在通常狀態下，陰道微生態由4個成分組成，分別是正常的陰道解剖結構、周期性的內分泌變化、陰道局部免疫系統以及陰道各種菌群。正常和異常陰道微生物群是由200多種細菌組成的復雜生態系統，受基因、種族背景、環境和行為、雌激素、抗生素、避孕藥等影響，陰道微生物群是動態變化的。

陰道微生態與女性常見的生殖道感染如細菌性陰道病、陰道念珠菌病、淋病、尿路感染，甚至婦科腫瘤都有著密切的聯系，是陰道微生態的失衡導致疾病的發生，還是疾病引起陰道微生態的改變的因果關系尚未清楚，但公認的一點是陰道微生態對女性泌尿、生殖系統健康十分重要。在治療方面，對于常見的女性生殖道感染通常的治療手段為抗菌藥物、激素、益生菌，通常使用抗菌藥物是為了消除致病菌，恢復正常的陰道菌群平衡，益生菌也有助于女性恢復健康的陰道微生態，陰道微生態在女性生殖道疾病中無論是病因方面還是治療方面都起著十分重要的作用。陰道微生態是在動態變化的，其中陰道菌群是陰道微生態的重要組成部分，在陰道微生態中各種菌群失衡必然會引起陰道微生態的失衡，進而導致多種婦科疾病的發生。

3.2 TLR4與陰道微生態平衡

3.2.1 TLR4與陰道優勢菌群 乳桿菌是女性陰道微生態中的優勢菌群。Mendling等研究發現個體的陰道健康主要是由幾種乳桿菌支配的。這些乳桿菌與抗菌物質、細胞因子、防御素和其他抵抗菌群失調、感染的物質以及對非早產的正常妊娠的護理一起支持防御系統，并且在菌群失調的情況下，乳桿菌的數量會增加。乳桿菌也是常見的益生菌，可以激活巨噬細胞和樹突狀細胞分泌細胞因子，從而調節宿主的免疫反應。乳桿菌產生的高濃度乳酸是決定陰道微生態的健康和失調的最重要因素，乳酸可以使陰道酸化，但在陰道微生態失調狀態下乳酸急劇下降，陰道pH值增大，并且乳酸在抗菌、抗病毒和免疫調節中也起著十分重要的作用。

乳桿菌在調節腸道中的炎癥時也起到關鍵作用。Compare等用炎癥后腸易激綜合征離體器官培養模型研究乳桿菌對粘膜炎癥的影響，發現干酪乳桿菌-DG能顯著降低脂多糖刺激后促炎細胞因子和TLR4的mRNA表達。乳桿菌在腸道中可以下調TLR4的mRNA水平，從而減少炎癥反應，乳桿菌在腸道對TLR4的影響已經有較多的研究，但乳桿菌在陰道對TLR4的影響的研究還不夠充分。

Rahbar等研究了陰道分離的乳桿菌對TLR4信號轉導的調節作用，發現在條件培養基(加入乳桿菌的胚胎牛血清的RPMI培養基)處理的CAOV-4細胞中，TLR4的mRNA和蛋白水平降低，但大腸桿菌(作為病原體陽性對照)處理的CAOV-4細胞中TLR4的mRNA和蛋白水平顯著升高。乳桿菌在陰道和腸道中一樣可以使TLR4的mRNA 和蛋白水平降低，從而減少炎癥反應。然而，Oerlemans等的一項關于需氧菌性陰道炎(aerobic vaginitis, AV)的研究發現，在大部分的AV患者中乳桿菌的豐富度降低，一些潛在的病原體或致病菌較正常陰道微環境增加了，但僅輕微刺激了TLR4，并且減少了TLR2/6的激活，研究人員推測可能是AV導致了陰道微生態的改變，而不是陰道微生態的改變導致了AV，因此恢復女性陰道微生態和乳桿菌平衡的益生菌在治療AV中具有重要意義。

TLR4介導的信號通路在炎癥反應中意義重大。在過去對于人體微生態的研究中，腸道菌群是一個研究熱點，乳桿菌在腸道中可以降低TLR4的mRNA水平從而減少炎癥反應。從研究腸道中的乳桿菌轉到陰道中的乳桿菌，研究人員發現陰道中的乳桿菌同樣可以降低TLR4的mRNA水平,從而減少炎癥反應。乳桿菌在女性陰道微生態和女性生殖道健康中的作用是十分重要的，其原因之一就是上文所述的乳桿菌可以調節TLR4介導的信號通路，而TLR4信號通路十分復雜，不止于上文涉及的TLR4/NF-κB信號通路，研究乳桿菌對TLR4信號通路上其他調控原件的影響，探索乳桿菌調控TLR4信號通路上更加完整的機制，將有助于更有效的抗炎藥物甚至抗癌藥物的研發。對于陰道微生態失衡與女性生殖道炎性疾病甚至癌癥的因果關系至今尚未明確，但無論因果，恢復女性陰道微生態平衡的益生菌對于女性生殖道健康都是有益的。

3.2.2 TLR4與陰道非優勢菌群

3.2.2.1 TLR4與淋病奈瑟菌 淋病奈瑟菌可以導致淋病，育齡女性感染嚴重淋病后會增加盆腔炎、異位妊娠和不孕等發生風險。淋病奈瑟菌嚴重危害女性健康,其是一種常見革蘭陰性菌，外膜有豐富的脂多糖。為了研究脂多糖及其同源受體TLR4在女性生殖道急性淋病奈瑟菌感染黏膜反應中的作用，Andrade等研究發現，淋病奈瑟菌感染誘導的 I 型干擾素依賴于cGAS/STING和TLR4信號通路。Packiam等用經陰道接種淋病奈瑟菌的小鼠進行實驗，發現TLR4信號通路可以調控女性生殖道淋病奈瑟菌感染早期的炎癥反應和控制細菌的復制。Yang等研究了TLR2和TLR4在子宮內膜上皮細胞感染淋病奈瑟菌后引起的損傷中的作用，發現淋病奈瑟菌可以抑制細胞活力，誘導細胞凋亡和炎癥反應，若TLR2/TLR4減少，可延緩由感染引起的細胞凋亡和炎癥，抑制感染引起的損傷。

淋病奈瑟菌感染引起的炎癥反應受到TLR4介導的信號通路的調控，當TLR4減少時，淋病奈瑟菌感染引起的炎癥反應也減少了。目前常用的治療淋病的方法是使用抗生素，抗生素的耐藥性問題在我國十分嚴峻，針對TLR4信號通路上的多個靶點，研發可以減少TLR4或其下游信號通路的制劑可以幫助臨床治療淋病甚至更多的感染和非感染性疾病。

3.2.2.2 TLR4與白假絲酵母菌 有研究表明，白假絲酵母菌可由共生模式轉變為致病模式，引起念珠菌病。Wang等研究發現，白假絲酵母菌在遇到少量的氮氣和豐富的血清時，會上調一個小的分泌型富含半胱氨酸蛋白Sell(一種富含半胱氨酸的小蛋白)的表達。這種Sell激活NF-κB和MAPK信號通路，導致促炎細胞因子和趨化因子的表達。研究人員綜合遺傳和生化分析發現，TLR2和TLR4都是識別Sell所必需的。該研究還證明了Sell能夠在巨噬細胞和樹突狀細胞中同時參與TLR2和TLR4的促進炎癥反應。

Roselletti等以健康女性、無癥狀白假絲酵母菌攜帶者和有癥狀的陰道念珠菌病患者為研究對象，發現無癥狀和有癥狀的受試者的內皮細胞中TLR2、TLR4和促紅細胞生成素產生肝細胞受體A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptorA2,EphA2)的表達水平顯著高于健康受試者，轉錄因子、NF-κB和c-Fosp38基因(原癌基因)在有癥狀和無癥狀的假菌絲/菌絲攜帶菌者的內皮細胞中被激活，而在無癥狀的酵母菌攜帶者的內皮細胞中未被激活，且研究人員發現僅在有癥狀的患者中觀察到內皮細胞的損害。

白假絲酵母菌可以引起念珠菌病，可累及患者的皮膚、黏膜甚至內臟。機體感染白假絲酵母菌后通過TLR2和/或TLR4進行識別，然后激活下游信號通路，最終激活NF-κB和MAPK信號通路，引起炎癥反應。臨床上通常用抗真菌藥物來治療白假絲酵母菌病，長期口服抗真菌藥易導致肝、腎損傷，研發針對TLR4信號通路抑制白假絲酵母菌的藥物將會有助于臨床治療。

3.3 益生菌在TLR4相關的陰道微生態中的應用 益生菌最初常用于改善腸道微生態。Yao等在研究益生菌對患有潰瘍性結腸炎大鼠TLRs表達的調節作用時發現，接受雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片治療的大鼠TLR4和TLR2的mRNA表達水平顯著降低。TLR4介導的信號通路可以引起炎癥反應，在腸道中某些益生菌可以減少TLR4的mRNA表達，從而減少炎癥反應，達到對某些腸道疾病治療的作用。

關于益生菌對TLR4介導的信號通路在陰道微生態中機制的研究還較少，但益生菌可以調節陰道微生態。乳桿菌是常見的益生菌，陰道中的乳桿菌可以降低TLR4的mRNA 水平從而減少炎癥反應。所以可以大膽地推測益生菌可通過降低TLR4的mRNA 水平，來治療某些疾病并調節陰道菌群。

益生菌在臨床上可用于治療婦科炎性疾病。Hanson等認為使用益生菌作為替代療法或共同療法可有效治療和預防泌尿生殖器感染。Russo等研究發現益生菌混合物、乳鐵蛋白與甲硝唑聯合使用可顯著改善細菌性陰道炎的癥狀，還可以改善Nugent評分和細菌性陰道炎的復發率。還有研究表明益生菌作為細菌性陰道炎常規治療(硝基咪唑、克菌定)的補充使用，有助于預防復發；但Xie等研究發現，與常規治療相比，使用益生菌作為輔助療法可以提高外陰陰道假絲酵母菌病的短期治愈率和真菌治愈率，并降低在一個月內的復發率，但對長期的治療效果似乎無影響。

在婦科炎性疾病的治療中，我國常用的益生菌制劑是定君生，其是一種陰道用乳桿菌活菌膠囊。多項研究發現，復方甲硝唑栓聯合定君生治療細菌性陰道病效果顯著,并且可以降低復發率。靳壽華以120例念珠性陰道炎患者作為研究對象，發現定君生聯合硝呋太爾制霉素治療念珠菌陰道炎，既可以清除念珠菌又可以改善陰道菌群及陰道的微環境。鄒端等研究發現，定君生聯合氟康唑可以有效治療重度外陰陰道假絲酵母菌病，既能抑制致病菌的生長，又能改善陰道微環境。還有研究發現乳酸與氟康唑聯合治療外陰陰道假絲酵母菌病，可明顯提高氟康唑的抗炎作用并且有效調節患者的陰道微生態。

TLR4作為識別革蘭氏陰性菌，激活NF-κB信號通路的重要受體，是引起局部或機體免疫和炎性微環境改變的重要環節，一直以來廣受研究人員的關注。陰道中的不同菌群只是陰道微生態的組成成分之一，只研究TLR4調控的陰道菌群是不夠的，還應該對TLR4與陰道的結構、女性內分泌變化、陰道局部的免疫系統進行研究。陰道菌群中的一些致病菌如淋病奈瑟菌、白假絲酵母菌都可以通過TLR4/NF-κB信號通路引起婦科炎性疾病。未來的研究可以針對該信號通路上的靶點設計研發新的藥物治療婦科炎性疾病。由于TLR4介導的信號通路是復雜的，未來的研究還可以探討TLR4介導的其他信號通路在調控陰道微生態上的機制，從而更全面的認識婦科炎性疾病甚至婦科腫瘤。