山東省水貂養殖場流感病毒防控及感染情況調查

薛瑞雪 陳峰 藺曉月 張棟 王苗利 王貴升* 周業森

（1，山東省動物疫病預防與控制中心 250100；2，青島農業大學動物醫學院 266109）

A 型流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，是一種有囊膜的單股負鏈RNA 病毒。根據血凝素（Hemagglutinin,HA）與神經氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性差異，目前將A 型禽流感病毒分為18 種HA 亞型和11 種NA 亞型，其中大部分亞型流感病毒來源于禽類[1]。自1994 年我國首次報道雞群中分離出H9N2亞型禽流感病毒以來[2]，該亞型流感病毒在我國廣泛存在，持續困擾養禽業[3,4]。

水貂是一種常見的經濟動物，水貂養殖業也是山東省畜牧業的重要組成部分。近幾年國內外關于水貂感染流感病毒的報道日益增多，2015 年，我國東部地區兩個水貂場爆發了H5N1亞型禽流感病毒，給當地養貂業造成較大的經濟損失[5]。而H9N2亞型禽流感病毒在水貂群傳播過程中，有的毒株已獲得適應哺乳動物突變，使其更容易感染水貂及人類[6]。因此，禽流感病毒在給水貂業帶來巨大經濟損失的同時還存在潛在的公共衛生風險，所以，加強對水貂流感病毒的監測和防控可避免造成公共衛生安全隱患。

1 調查方法

1.1 網上問卷調查

網上設置調查內容：養殖場地點、飼料種類、養殖環境、免疫接種等問題。將問題發送給山東省主要的水貂養殖戶填寫調查問卷。經過30d 共收集不同地市養殖戶114 家，對調查結果進行整理、匯總，得到相關數據。

1.2 樣品采集及檢測

1.2.1 樣品及主要試劑

2020 年8 月～12 月從威海、泰安、菏澤、濰坊水貂養殖場共采集181 份發病水貂肺臟器官。

Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、RNA 抽提試劑TRIzol、Gel Extraction Mini Kit、pMD18-T 克隆載體、Top 10 感受態細胞、DL2000 DNA Marker 均購自TaKaRa 公司；A型流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒；H9亞型、H7亞型和H5亞型禽流感分型熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒購自世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.2.2 樣品檢測

取適量各病料組織置于離心管中，加入適量的pH 7.2 的PBS 研磨成勻漿，反復凍融3 次，8000 r/min 離心5 min，取各病料上清液200 μl，按照RNA 提取試劑盒說明書從病料中提取RNA，以其為模板，采用A 型流感病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒對121 份樣品進行檢測。

1.2.3 引物設計

根據GenBank 收錄的有關流感病毒序列，用Primer 5.0 設計流感病毒HA 和NA 擴增引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

表1 全基因擴增引物

1.2.4 目的基因的RT-PCR 擴增與克隆測序分析

取各病料上清液200 μl，按照TRIzol 說明書方法提取樣品總RNA。一步法RT-PCR 反應體系總體積為50 μl：2x1 Step Buffer 25 μl，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl，RNA 2 μl，RNase Free ddH2O 17 μl。反應條件為：50 ℃30 min，95℃3 min，1 個循環；94 ℃30 s，53℃30 s，72 ℃1 min，32 個循環；72 ℃10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收產物克隆至pMD18-T 克隆載體由上海生工生物工程技術有限公司測序中心進行測序鑒定。

2 結果與分析

2.1 水貂飼料種類

養殖場飼喂飼料的種類有生鮮料，熟化后加工飼料和顆粒料。而生鮮料由于沒有經過熟化，常可作為一些病毒細菌的傳染源。其中流感病毒可通過飼喂未熟制加工過的生鮮飼料感染水貂。對濰坊、日照、菏澤、威海、濱州5 個地市114 家水貂養殖場進行了調查問卷，由圖1 可知，在水貂飼料中生鮮料所占比例較大，尤其是濰坊地區生鮮飼料所占比例最大，而濰坊地區不靠近海，生鮮飼料主要以禽類產品為主，這也為禽流感病毒在水貂中的傳播帶來了更大的可能。

圖1 不同地市生鮮料使用情況

2.2 養殖場養殖模式、周圍環境有害傳播媒介及應對措施

經調查，大部分水貂養殖屬于院舍式養殖模式，周圍活動的野鳥也會為流感病毒的傳播帶來可能。由圖2 可知，養殖場周圍有野鳥活動的養殖場36 家，占總養殖場數量的31.58%，這些養殖場在棚舍內放置藥餌對鳥類進行誘殺（占8.77%），有些養殖場使用專用料蓋遮擋（占5.26%），也有些噴灑專用藥物（占7.02%），這措施在一定程度上減少了鳥類對水貂健康養殖的影響。但仍有一部分水貂養殖場未采取相應的措施（占10.53%），這將增加水貂感染的可能性。

圖2 養殖場周圍環境及采取措施

2.3 發病水貂處理方式

由圖3 可知，水貂發病后仍有部分養殖場未經消毒直接銷售，給流感病毒的傳播帶來可能。但大部分養殖場都會處理，如無害化處理或消毒后再銷售，這說明大部分養殖戶有較強的疫病控制意識。

圖3 發病水貂處理方式

2.4 流感疫苗免疫接種

經調查發現，當前大多數養殖場的免疫只針對犬瘟熱和細小病毒，且目前沒有針對水貂流感的商品化疫苗。沒有疫苗保護增加了水貂感染流感病毒發病的可能。

2.5 臨床樣品流感病毒檢測

采用A 型流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒對181份樣品進行檢測，檢測結果顯示有2 份為流感病毒陽性，這兩份病料來源于一個養殖場。經H9亞型、H7亞型和H5亞型禽流感分型熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒檢測顯示均為H9亞型禽流感病毒。

2.6 HA 和NA 基因遺傳進化分析

為進一步分析本次鑒定毒株的遺傳進化關系，依據國內外流行毒株及國內外參考毒株核苷酸序列的同源性，使用MegAlign 軟件繪制了HA 基因（圖4）和NA 基因（圖5）的系統發育進化樹。結果表明，該株病毒的HA 和NA 基因均屬于Y280-like 毒株，為H9N2亞型禽流感病毒。

圖4 H9N2 亞型禽流感病毒HA 基因系統進化樹

圖5 H9N2 亞型禽流感病毒NA 基因系統進化樹

經與養殖場聯系發現，該場水貂的飼喂方式為生鮮料飼喂，且養殖模式為庭院式養殖，未采取野鳥控制措施，并未免疫流感疫苗。這有可能是該養殖場飼喂了發病禽的生鮮料導致水貂感染流感病毒。

3 討論

流感病毒為RNA 病毒，基因組很容易發生變異，由于缺乏糾錯機制，在病毒復制過程中產生的錯誤一代代積累，使病毒發生質的變異。目前國內隨著水貂感染流感病例越來越多，流感在水貂中感染的情況已不容忽視。一方面，低致病性流感病毒感染后會造成幼貂存活率下降，高致病性禽流感病毒會造成高死亡率，經濟損失嚴重[6]。另一方面，流感病毒長期對水貂感染適應后會增強對哺乳動物的適應性，對人類公共衛生安全造成較大威脅。有研究發現，禽源H9N2亞型流感病毒在水貂群傳播過程中已獲得Q226L 的突變，使得該病毒易與哺乳動物上呼吸道唾液酸受體結合，更容易感染人類[7]。而且，H5亞型流感病毒的T160A 突變也是禽流感病毒適應哺乳動物的突變[8]。

本次養殖場樣品檢測到的流感病毒HA 和NA 遺傳進化分析顯示均屬于Y280-like 亞系，與近年其他省份禽源H9N2亞型流感病毒檢測結果一致[9-10]。提示本次水貂感染為禽源流感病毒感染所致。因此，應加強水貂中流感病毒的監測和防控，盡快建立水貂流感病毒的監測機制，提高養殖戶的生物安全意識。