雞胚成纖維細胞永生化構建機制的驗證

徐婧祎 安于 陳秀紅 何生虎

（寧夏大學 750021）

所謂細胞系(Cell line) 指原代細胞經環境或認為調控后能多次傳代的細胞群體。本實驗雞成纖維細胞永生化后獲得的就是能穩定傳代并沒有雜細胞的系統。穩定細胞系構建是將外源質粒整合到目的細胞染色體上的一個過程，這一過程使得宿主細胞能長期并且穩定的表達蛋白[1-5]。慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體[6]。與傳統意義的逆轉錄病毒載體相比，其對感染能力更強。本實驗通過逆轉入病毒，慢病毒感染，篩選穩定細胞株這一方式達到細胞永生化的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

電熱恒溫震蕩水槽（上海精宏實驗設備有限公司）；T25 細胞培養瓶（Corning）血球計數板、24 孔板專用細胞玻片、細胞培養孔板（Solarbio）；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）（Gibco）；多聚甲醛（PFA）、DAPI、Triton X-100、山羊血清（Solarbio）；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（Proteintech）、SV40 過表達慢病毒（漢尹生物）。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細胞的分離培養

取10 日齡左右雞胚，用75%酒精消毒蛋殼，從氣室端用鑷子小心取出雞胚，置于培養皿中，用眼科剪小心除去頭、四肢和內臟部分，剩余胚體用PBS 清洗3 次，將洗凈的胚體剪碎，并反復清洗3 次，收集剪碎的胚體，加入0.25% Trypsin 37℃水浴震蕩消化30～40min，將消化液過100μm 濾網，收集濾液，300g 離心5min，棄上清，重懸沉淀，鋪瓶。

1.2.2 免疫熒光鑒定

細胞玻片；固定；破膜封閉；一抗孵育，（抗體：PBS 為1:100），破膜封閉后，取50uL 一抗于防水膜上（濕盒中），蓋玻片后4℃恒溫加（最多可放置一周）二抗，室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h 后，PBS 洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS 洗3×5min/次；包埋，玻片上各滴1 滴Fluoromount-G，將有細胞的一面蓋上。

1.2.3 雞胚成纖維細胞的轉染

1.2.3.1 過表達慢病毒選擇

本實驗選用的慢病毒載體元件信息為EF1α-SV40-IRES-puromycin，GFP 為熒光標記基因，Puromycin 抗性基因標記。

1.2.3.2 轉染

將雞胚成纖維細胞接種6 孔板，每孔細胞數約為1×105個；24h 后細胞貼壁，換液；加入1ml 完全培養基，再加20μL SV40 過表達慢病毒；12h 后觀察細胞狀態，并更換為新鮮培養基；觀察細胞貼壁超80%，分瓶至T25 培養瓶中。轉染后細胞擴增3～4 代后進行篩選。

1.2.4 雞胚成纖維細胞的篩選

1.2.4.1 殺滅曲線

未處理的雞胚成纖維細胞按每孔0.05million 鋪入24 孔板，孵育過夜；第2 天，棄掉廢液；將含不同濃度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）的新鮮培養基加入已鋪有細胞的24孔板；每2d 換篩選培養基一次；每天觀察細胞的變化；最小的嘌呤霉素使用濃度是從嘌呤霉素篩選開始1～4d 內殺死所有細胞的最低篩選濃度。

1.2.4.2 嘌呤霉素篩選轉染細胞

首日，將轉染的雞胚成纖維細胞按每孔0.05million 加至24孔板，孵育過夜；24h 后除去板中廢液；加入含嘌呤霉素（1ug/ml）的篩選培養基，孵育，對篩選后的細胞進行擴增。

1.2.5 雞胚成纖維細胞的擴增

倒出廢液，加入無菌pbs 洗液（5～8ml）輕輕潤濕細胞，之后吸走洗液；向瓶內加入含0.25%EDTA 的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限；置溫箱中2～5min，終止消化；加入該細胞對應的培養基6ml 終止消化，形成細胞懸液。依據傳代比例，將細胞懸液分瓶，再補充培養基后，靜置于溫箱培養，直至貼壁。

2 結果

2.1 原代細胞收集

原代細胞分離后，細胞分布均勻但仍有少量雜細胞分布，細胞活性良好。

2.2 免疫熒光鑒定

通過DAPI 染色，細胞核結構正常，熒光顯微鏡下觀察有藍色熒光，用Fluoromount-G 封片劑后封片，可以清晰看到細胞分布均勻且間距勻稱，熒光反應明顯，見圖1。

圖1 DAPI 染色及封片熒光圖

2.3 轉染結果

用慢病毒包裝轉染雞胚胎成纖維細胞，24h 后實驗細胞被接種在滅活飼養層，在轉染5d 后出現明顯的菌落細胞，表現出典型的干細胞大核和核仁顯著等特點。穩定重編程細胞培養在無飼養層的培養皿中，獲得的細胞在人工基膜上傳代超過50代次，表明這些細胞獲得永生性特征，見圖2。

圖2 慢病毒轉染后細胞顯微鏡結構

2.4 殺滅濃度及嘌呤霉素篩選轉染細胞

通過未轉染的雞胚成纖維細胞與不同濃度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）作用后，可見嘌呤霉素篩選開始1～4d 內殺死所有細胞的最低篩選濃度，確定使用濃度為1ug/ml，作用時間為2d。

將上一步得到的結果用于已轉染的雞胚成纖維細胞，作用2d 后通過顯微鏡可見白色亮點為已死細胞，貼壁細胞即為轉染成功后的雞胚成纖維細胞。

2.5 雞胚成纖維細胞永生化后擴增

將上一步得到的已轉染的雞胚成纖維細胞通過胰酶消化法進一步擴增，擴增到12 代時，通過顯微鏡觀察得到如下圖片所示結果，可見細胞數量多，分布均勻，體態完整，形態正常，為紡錘形或星型，貼壁，見圖3。

圖3 初代永生化細胞

3 討論

目前，國內外關于雞胚成纖維細胞原代培養的方法比較常見，傳代穩定的雞胚成纖維細胞系常用的是商品株DF-1，但雞胚成纖維細胞通過永生化而轉化成穩定傳代細胞系的報道比較少見。

本實驗中通過慢病毒感染進一步獲得需要細胞。病毒轉染細胞的過程包括病毒與目的細胞吸附、病毒變形內化、入胞、細胞內再定位、病毒脫衣殼、入核、復制及包裝[7]，本實驗中用于細胞改造的慢病毒毒性基因已被剔除屬于假型病毒[8]，感染目的細胞后不會再感染其他細胞，并且不會在宿主細胞內復制，具有低毒性，在實驗過程中也不會發生特異性反應[9-11]。實驗結果通過一系列驗證，目的細胞永生化，通過這一試驗為以后其他種類的纖維細胞永生化提供一定的基礎。