角膜營養不良家系的共焦顯微鏡觀察研究

應方微，唐松，張醇，黎明

(深圳市眼科醫院病理室，深圳市眼科學重點實驗室，暨南大學附屬深圳市眼科醫院，廣東 深圳 518040)

角膜營養不良是一組與遺傳有關的，具有病理組織學特征的疾病[1]。現對深圳地區的一個角膜營養不良家系中的4名患者的患病角膜進行病理及共焦顯微鏡的觀察研究。

1 材料與方法

1.1 材料

深圳地區一個角膜營養不良家系顆粒狀角膜營養不良角膜患者4名(6只眼)角膜。

1.2 病例資料

病例1，男，25歲，臨床診斷為角膜營養不良，行右眼穿透性角膜移植術+前房成形術，術后病理診斷為“顆粒性角膜營養不良”，目前隨訪無異常。在問詢病史時，得知該患者的數名親屬有類似病癥，故對該家庭成員進行了探訪，發現了1個顆粒狀角膜營養不良的家系。

1.3 HE 染色

對角膜營養不良家系顆粒狀角膜營養不良角膜6例角膜進行常規固定脫水后，石蠟包埋、切片后常規HE染色，置于顯微鏡下觀察。

1.4 角膜激光共焦顯微鏡檢查

1.4.1 儀器

角膜激光共焦顯微鏡(Heidel berg Rostock Cornea Module，Heidelberg Engineering Inc，Germany)購自德國海德堡公司，主要裝置為Rostock角膜纖維物，外部電子部件為Heidelberg Eye Explorer，Heidelberg Eye Explorer License Manager，Heidelberg Retina Tomograph III Cornea Module系統。

1.4.2 主要參數

放大倍數為800×，激光源為670 nm波長，二維圖像大小為384×384像素。顯微物鏡的屈光度設定為+12 D，深度值應在?150 μm和+150 μm之間。

1.4.3 操作步驟

用0.5%愛爾凱因表面麻醉3次；清潔纖維鏡頭的前表面，鏡頭的前表面點一大滴Vidisic?凝膠，避免氣泡逸入；無菌角膜接觸鏡安裝于物鏡頭上，患者注視前方的固視光點，調節圖像傳感器(charge-coupled device，CCD)的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直。將激光掃描攝像頭前移，使角膜接觸帽接觸患者角膜，觀察到角膜圖像時，微調焦距，掃描角膜各層的圖像并記錄。

1.4.4 圖像及數據處理

應用NAVIS圖像軟件系統和Heidelberg Retina Tomograph III Cornea Module圖像分析軟件進行觀察、對比。

2 結果

2.1 臨床病理情況

該家系共5例患者發病，年齡最小的為25歲男性，年齡最大為76歲女性(拒絕治療)，其余共4例發病患者均進行了單眼或雙眼的穿透性角膜移植手術，隨訪狀況均良好。除1例36歲男性患者訴角膜開始出現混濁癥狀10年，其余各位患者均為自幼發病，角膜混濁，視力逐漸模糊。裂隙燈檢查可見患者角膜上皮下，基質層均可看到彌散圓形面包屑樣點狀混濁(圖1)，有時可見基質融合片狀混濁，病變可涉及到基質全層。

圖1 裂隙燈下前段照相 Figure 1 Slit lamp front section photography

2.2 病例家系圖

該家系發病患者5例，女性患者2例，男性患者3例，可查三代內均有患者分布(圖2)。

圖2 顆粒狀角膜營養不良家系圖Figure 2 Family of granular corneal dystrophy

2.3 HE 染色

可見角膜上皮變性，厚薄不均，前彈力層消失，自上皮下至全層基質見嗜伊紅顆粒狀沉積物沉積(圖3)，診為顆粒狀角膜營養不良。

圖3 顆粒狀角膜營養不良病理圖像(HE，×100)Figure 3 Pathologic image of granular corneal dystrophy (HE,×100)

2.4 角膜激光共焦顯微鏡觀察

患病角膜上皮細胞往往結構尚清晰，基質可見大片的混濁，基質細胞缺失，顆粒狀沉積物表現為中-高反光結構(圖4)，大量的高反光沉積物占據、替代基質細胞(圖5)。

圖4 顆粒狀角膜營養不良共焦顯微鏡圖像(×800)Figure 4 Confocal laser scanning microscopy image of granular corneal dystrophy (×800)

圖5 顆粒狀角膜營養不良共焦顯微鏡圖像(×800)Figure 5 Confocal laser scanning microscopy image of Granular corneal dystrophy (×800)

3 討論

由于角膜營養不良是一種遺傳性疾病，因此眾多學者很早就開始了對其分子遺傳學方面的研究。目前確定的與角膜營養不良相關的染色體有1、5、9、10、12、16、17、20、21和X染色體，已經確定的角膜營養不良基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S1、GSN等[2]。

角膜營養不良在我國較為常見，我們所掌握的深圳地區的一個家系中三代可查人數為18人，顆粒狀角膜營養不良患者5人。對該家系的研究結果顯示：高、低分子量細胞角蛋白在本角膜營養不良家系患者的角膜中有陽性表達，正常角膜則沒有表達[3]。研究[4]顯示：顆粒狀角膜營養不良角膜超微結構，可見部分角膜上皮基底細胞和實質細胞內外均有高電子密度的梭形物質，上皮的基底細胞及實質細胞參與沉積物的形成。顆粒角膜營養不良的發生與角膜上皮的改變可能有關聯，角膜上皮中高分子細胞角蛋白明顯增加并可能分泌至周邊參與沉積物的形成。復習患病角膜的共焦顯微鏡觀察圖像，顆粒狀角膜營養不良鏡下的沉積物在共焦顯微鏡下可見呈團塊狀中高反光，周圍可見大量粉末狀的反光影，逐步擴展病變達到占據基質層，取代基質細胞。進一步印證了角膜上皮細胞及實質細胞參與了顆粒狀角膜營養不良的發展。

共焦顯微鏡是臨床實時觀察角膜的高分辨率檢查設備，在健康角膜激光共焦顯微圖像上，前彈力層神經纖維，呈連續走行的高反光條索狀結構，走行略迂曲，邊界光滑，結構清晰[5]。作為活體無創性的檢查手段，共焦顯微鏡可以觀察角膜病變的動態發展情況，不僅能分辨上皮細胞層中的表皮細胞、翼狀細胞、基底細胞，還可顯示角膜總不同層次的神經形態。活體共焦顯微鏡借助眼部特殊結構和特性，直接觀察角膜及其他眼表結構的細胞圖像，不需要傳統送檢的步驟，任意選取疾病的時間段進行疾病的動態跟蹤，有助于優化眼表疾病的診斷治療，重新定義眼表疾病的特征，可在一定程度替代眼表疾病的病理診斷功能。

角膜營養不良的患病角膜的沉積物從何而來，在發病機制中扮演了什么角色，發生角膜營養不良的原因為何，上述問題目前尚未完全清楚，但是隨著科技的不斷發展，新的技術手段的問世，我們將獲得越來越多先進的手段來進一步研究闡明這些問題。

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