正確認識眼內淋巴瘤分子病理檢查結果

苗恒，梁建宏

(北京大學人民醫院眼科，眼病與視光醫學研究所，視網膜脈絡膜疾病診治研究北京市重點實驗室，北京大學醫學部眼視光學院，北京 100044)

眼內淋巴瘤是一種主要累及葡萄膜、視網膜和玻璃體的惡性腫瘤性疾病，按主要累及組織和部位可分為玻璃體視網膜淋巴瘤和葡萄膜淋巴瘤[1]。約90%的眼內淋巴瘤起源于B淋巴細胞，此外起源于T淋巴細胞和NK/T細胞的眼內淋巴瘤也偶有報道[2]。玻璃體視網膜淋巴瘤的病理類型多為彌漫大B細胞淋巴瘤，而葡萄膜淋巴瘤則多起源于黏膜相關淋巴組織，病理類型多為結外邊緣區B細胞淋巴瘤[3]。眼內淋巴瘤大多起病隱匿、進展緩慢，葡萄膜淋巴瘤更因惰性度高而一度被認為是良性淋巴增生性疾病[3]。雖然眼內淋巴瘤具備相對特征性眼底和影像學表現，但因其表型多樣且經常伴隨不同程度的眼內炎性表現而被誤診、漏診。

隨著多模式影像、微量標本分子和細胞生物學檢測技術的發展，眼內淋巴瘤的診斷率和檢出率逐年提高，眼科醫生對此類疾病的認識也逐年加深[4]。雖然眼內組織/細胞病理至今仍然是眼內淋巴瘤診斷的金標準，但受限于采樣技術、標本保存/運輸、病理診斷技術水平等因素，眼內淋巴瘤病理診斷陽性率始終偏低[5]。相比之下，只需要少許眼內液即可輕松完成的細胞因子檢測、流式細胞免疫分型和基因重排等技術則具備標本獲取和保存難度低、檢測方法成熟且方便等優勢，備受臨床醫生推崇，甚至大有在診斷眼內淋巴瘤時只單純依據此類分子/細胞生物學的方法而完全放棄病理診斷的趨勢。認識眼內液分子/細胞生物學檢測手段的優勢和局限性，重視并規范眼內淋巴瘤的病理診斷流程，不但有助于加深對該類疾病臨床表現的認識，還有助于借助分子/細胞生物學手段探究其發病機制，為優化此類疾病的治療方案奠定理論基礎。

1 認識眼內液分子/細胞生物學檢測手段的優勢和局限性

目前臨床用于診斷眼內淋巴瘤的分子/細胞生物學手段主要包括白細胞介素10/6比值(interleukin 10/6，IL-10/6)、免疫球蛋白重鏈/T細胞受體(immunoglobulin heavy chain/T cell receptor，IgH/TCR)基因重排和流式細胞免疫分型技術[4]。

IL-10/6因標本來源簡單及檢測方法成熟快捷等原因而被廣泛用于臨床疑似眼內淋巴瘤患者的篩查環節。房水IL-10/6>1診斷眼內淋巴瘤的敏感性為75%～88%，特異性為75%～85%，而玻璃體IL-10/6>1診斷眼內淋巴瘤的敏感性和特異性更是分別高達93%和100%[6]。但需要指出的是，該方法成立的前提：患眼為玻璃體視網膜淋巴瘤，腫瘤細胞來源于B淋巴細胞，且要排除可導致IL-10升高的其他原因。葡萄膜淋巴瘤常惰性生長且位于血-視網膜外屏障之外，因而很難通過脈絡膜活檢之外的方法明確診斷，眼內液IL-10/6也通常<1[7]。雖然>90%的眼內淋巴瘤均來源于B淋巴細胞，但少數情況下，T淋巴細胞和NK/T細胞來源的眼內淋巴瘤也可發生，但此時IL-10并不升高，因而會造成IL-10/6<1的現象。此外，已有報道[8]表明，眼內淋巴瘤之外的疾病如處于特定階段的急性視網膜壞死等，也可出現IL-10水平升高甚至IL-10/6>1的情況，此時需要臨床醫生結合病史、臨床表現和患眼對治療的反應以明確診斷。

IgH/TCR基因重排技術是一種基于PCR判斷標本中是否存在單克隆淋巴細胞的分子生物學手段。在血液腫瘤領域，IgH/TCR基因重排已具備標準化的檢測流程(EuroClonality/BIOMED-2指南)且已是確定診斷的常規依據之一[9]。但在眼科領域，受到標本采集量，特別是標本微切(micro-dissection)技術實現難度大的限制，該技術至今仍沒有標準化流程可循，直接將眼內液標本整體或離心后取沉淀送檢的假陰性率仍然偏高(約40%)[10]。此外，基因重排結果陽性僅表示該標本中存在單克隆的B/T淋巴細胞，卻并不表示此類細胞一定是腫瘤細胞。炎癥背景下的淋巴細胞單克隆反應性增生也是基因重排陽性的原因之一[11]。因此在獲得基因重排陽性結果后，還要綜合其他診斷手段判斷其性質，而不能據此確診眼內淋巴瘤。

流式細胞免疫分型是基于流式細胞術和大樣本數據的細胞定量分型技術，可快速計數標本中特殊免疫表型的細胞數量和百分比，同樣也是血液腫瘤診斷的常規檢測項目之一。在眼科領域，因眼內液標本獲取相對困難且細胞密度低，標本分裝后用于流式細胞免疫分型的細胞總數通常至多只有2 000個，且因標本采集、保存、運輸、處理等原因，“不典型”免疫表型的細胞常見。此外，如同基因重排一樣，即便檢測到κ/λ限制性表達的淋巴細胞，也只能說明標本中存在單克隆的淋巴細胞，但其意義不明[12]，因而不能作為眼內淋巴瘤的確診依據。

IL-10/6、IgH/TCR基因重排和流式細胞免疫分型技術都是依據淋巴瘤細胞的生物學特性，檢測其存在時可能發生的繼發現象，進而間接推理其存在的方法，任何一種方法均不能直接“見到”也不能確定腫瘤細胞的存在。雖然該類檢測方法具有簡便和高效的特征，但終究不能作為眼內淋巴瘤的確診依據或診斷金標準。

2 重視眼內組織/細胞病理對眼內淋巴瘤的診斷價值

病理是腫瘤類疾病診斷的金標準[4]。對眼內淋巴瘤而言，獲得病理依據不但可以明確診斷，還可根據免疫組織化學染色結果判斷其病理類型并預測預后。雖然相比現今各種眼內液分子/細胞生物學檢測手段，眼內組織/細胞病理具備采樣難度大，標本保存運輸困難，受各地病理診斷水平限制等短板，但不容置疑的是，眼內組織/細胞病理可在直視下證實腫瘤細胞的存在，因而仍然是眼內淋巴瘤的診斷金標準方法，是此類疾病診斷時必不可或缺的送檢項目之一。雖然因各種原因，其敏感性低于眼內液分子/細胞生物學手段，但也不能因此而放棄送檢病理標本甚至忽視其重要性。

3 規范和優化眼內組織/細胞病理標本的采集、保存和送檢流程

有效采集眼內組織/細胞病理標本可顯著改善眼內淋巴瘤的病理診斷效率。1)采樣前應停用糖皮質激素類藥物至少2周以避免其誘導的淋巴細胞凋亡[13]。2)采樣時首選玻璃體切割術中標本，切速≤800 min?1，且在不打開灌注的情況下干切眼底病灶附近的玻璃體，提高腫瘤細胞采集陽性率[13]。3)采樣時同時采集玻璃體原液和灌洗液并分別送檢可提高陽性率[14-15]。4)玻璃體視網膜淋巴瘤患眼首選玻璃體標本，而葡萄膜淋巴瘤則需根據腫瘤累及部位和標本獲取的難易程度判斷標本種類和標本獲取方式：若腫瘤只累及脈絡膜則只能選擇脈絡膜標本，但若腫瘤同時/主要/只累及睫狀體，則經鞏膜入路的睫狀體活檢為首選方法，對同時/主要/只累及虹膜的患眼則可經角鞏膜緣入路獲取虹膜標本[16]。對首次玻璃體標本活檢陰性但仍高度疑似玻璃體視網膜淋巴瘤的患眼，可進行二次玻璃體活檢或選擇病灶處視網膜活檢；因淋巴瘤細胞主要位于視網膜色素上皮與Bruch膜之間，送檢組織應包含視網膜色素上皮層及其附近組織[17]。5)玻璃體標本在采集后應立即放入細胞培養液中(如含葡萄糖的RPMI1640)并于1 h內送病理科[18]。如果能在取材后立即就地完成甩片和固定過程而后再送檢則形態更佳。6)固定液可顯著影響腫瘤細胞形態，PreservCyt固定液可有效保護淋巴瘤細胞的形態和DNA的完整性[19]。7)玻璃體原液在離心后，上清可送檢IL-10/6，沉淀重懸后可送檢病理和IgH/TCR基因重排。而灌洗液則可在離心后取沉淀，重懸后送檢流式細胞免疫分型，以最大化利用標本[17]。8)細胞病理甩片標本可進一步通過標本微切(micro-dissection)技術切取其中高度疑似腫瘤細胞的部分進行IgH/TCR基因重排檢測，以提高其陽性率[20]。

綜上，眼內液分子/細胞生物學技術雖然簡便快捷，但因其本身只能作為眼內淋巴瘤診斷的“間接證據”而不能作為確診依據。眼內組織/細胞病理仍然是眼內淋巴瘤診斷的金標準，其價值和地位不能被其他任何分子/細胞生物學檢測手段所替代。規范和優化眼內組織/細胞病理標本的采集、保留和送檢流程對提高眼內淋巴瘤的病理診斷率有重要意義。眼科醫生應充分理解并掌握各種診斷、檢測技術的優勢和局限性，在臨床工作中有側重的選擇恰當的診斷技術，提高眼內淋巴瘤的診斷效率，提高醫療質量。

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