非洲豬瘟病毒與天然免疫系統相互作用研究進展

屈海龍，戈勝強，張永強，韓乃君，孫成友，吳曉東，王志亮 (中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的一種出血性豬病毒性疾病，可以感染野豬和家豬。強毒株感染的致死率可達100%，毒性較低的毒株可導致亞臨床癥狀，甚至是慢性感染。該疾病的急性形式以發燒、食欲不振、嗜睡和出血為特征[1]。由于ASF的破壞性影響，該疾病被列入世界動物衛生組織(OIE)必須報告的疾病。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，屬于核質巨DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)[2]。最早在1921年，ASFV在肯尼亞作為一種地方性病毒被首次發現[3]。自此，ASF在許多撒哈拉以南國家流行。20世紀中葉擴散到歐洲，后來又擴散到南美洲和加勒比地區。20世紀90年代，歐洲(撒丁島除外)通過嚴格的生物安全計劃和措施控制并凈化了ASF。但僅僅控制了10年，在2007年，ASFV通過格魯吉亞重新進入歐洲，并迅速蔓延到俄羅斯等東歐等國家[4-6]。2014年，ASFV 首次傳入歐洲聯盟(EU)國家[7]。2018年8月，我國暴發首起ASF疫情，截止到2021年7月，我國31個省、市、自治區、直轄市共計暴發187起ASF疫情，給養豬業帶來了災難性的影響，嚴重影響了我國畜牧業經濟的發展。由于ASFV復雜的生物學特性以及感染引起的宿主免疫反應機制還不完全清楚[8]，目前還沒有針對ASF的商業化疫苗和抗病毒藥物[9]。但是，研究人員在抗ASFV免疫和開發ASF候選疫苗方面做了大量的工作[10]，給未來疫苗及抗病毒藥物的研發帶來了希望。

天然免疫系統是抵御所有感染的第1道防線，是特異性免疫反應的前哨[11]。ASFV可以感染脊椎動物(家豬和野豬)，也可以感染無脊椎動物(軟蜱)，而這2個宿主只有天然免疫反應是共同的，因此可以合理地推測ASFV已經進化出操縱宿主天然免疫系統的基因，以維持自身對宿主的持續感染[12]。近年來，隨著不斷深入研究，ASFV感染與宿主天然免疫系統的關系不斷被揭示，現就ASFV感染與宿主天然免疫應答及其免疫抑制機理研究的進展進行綜述，希望能為ASF的防控提供參考。

1 ASFV概述

ASFV是一種線性的有囊膜的雙鏈DNA病毒，完整的病毒顆粒有5層結構，總體上呈二十面體形態，直徑大小為260～300 nm[2,13]。ASFV具有線性雙鏈DNA基因組，大小為170～194 kb，可編碼150～170個開放閱讀框(ORF)，其中近一半基因的功能尚不清楚[14-15]。ASFV顆粒包含50多種蛋白[13,16]，并可在感染細胞中產生150多種蛋白質[14,17]。ASFV的主要靶細胞是豬的單核細胞/巨噬細胞[18-19]，也可在其他類型細胞中復制，包括肝細胞、腎小管上皮細胞、中性粒細胞和內皮細胞[20-22]。根據ASFV B646L基因C末端核酸序列的差異和紅細胞吸附抑制實驗，將ASFV分成了24個基因型8個血清群[14,23]，引起我國暴發首起ASF疫情的毒株屬于基因Ⅱ型血清8群[24]。

2 ASFV與干擾素

干擾素是由多種細胞產生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的可溶性糖蛋白，分為Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素，是天然免疫的重要組成部分。Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，Ⅱ型干擾素具有較強的免疫調節作用。干擾素能抑制病毒在細胞內的傳播和早期感染細胞的細胞間傳播，從而抑制病毒在感染細胞中的復制[11]。

2.1 ASFV抗宿主Ⅰ型干擾素反應病毒通常通過病原體相關分子模式(PAMP)，被細胞表面或細胞質中的細胞模式識別受體(PRR)識別。先天性免疫反應在感受到PAMP時被觸發，誘導Ⅰ型干擾素表達[25-26]。ASFV作為細胞質DNA病毒，DNA的感應途徑可能是感應感染和誘導Ⅰ型干擾素的關鍵。目前，尚不清楚在ASFV感染巨噬細胞時PAMP和PRR的具體機制[8]。

先前的研究表明，ASFV編碼的MGF360和MGF505(也稱為MGF530)通過抑制宿主細胞干擾素表達，達到抑制病毒胞內復制的目的[27]。Pr4Δ35為缺失8個MGF360和MGF505基因的重組毒株，可在體外誘導豬巨噬細胞產生IFN-α，而親本Pr4株則不會。在用2 000 IU/mL重組IFN-α處理肺泡巨噬細胞后，Pr4Δ35的復制顯著減少。相比之下，親代Pr4病毒的復制則不受IFN-α的抑制[27-28]。IFN-α不會影響強毒ASFV(BA71、Georgia 2007/1、OUR T88/1)在肺泡巨噬細胞中復制的能力。但是，通過用2 000 IU/mL重組IFN-α預處理細胞，OUR T88/3的復制減少了約90%[28]。作為MGF360的成員，A276R基因不僅通過靶向干擾素調節因子3(IRF3)抑制其活化，從而抑制IFN-β表達，而且還能抑制核轉錄因子κB(NF-κB)活化，但抑制NF-κB活化與抑制IFN-β表達沒有關聯[12,29]。MGF360-12L可以通過阻斷核轉運蛋白輸入蛋白(importin α)和NF-κB信號通路的相互作用來抑制Ⅰ型IFN的產生[30]。MGF505-7R(A528R)通過同時抑制IRF3和NF-κB轉錄因子來抑制Ⅰ型IFN的誘導，該蛋白還抑制Ⅰ型和Ⅱ型干擾素信號通路[12]。MGF505-7R缺失的ASFV比野生型ASFV在體外誘導更多的IFN-β產生，并且其在體外復制能力減弱[31]。從ASFV強毒株中刪除不同數量的MGF360和MGF505基因，構建的重組ASFV表現出明顯的毒力降低，并且能夠誘導宿主免疫保護反應，保護宿主免受強毒株的攻擊[32-34]。ASFV的I329L蛋白與細胞膜上高度糖基化的Toll樣受體3(TLR3)十分相似，能夠抑制宿主天然免疫系統中的2個重要因子NF-κB和IRF3的激活，從而抑制宿主IFN-β表達[12,35]。ASFV在細胞水平上抑制Ⅰ型干擾素表達，但是研究人員發現被ASFV強毒株感染的豬血清中存在有活性的干擾素，并且同時檢測到IFN-α和IFN-β[28,36]，這說明干擾素的表達在體內和體外還是有區別的，需要進一步研究。

2.2 ASFV抗宿主Ⅱ型干擾素反應Ⅱ型干擾素又稱干擾素γ(IFN-γ)，主要由活化的T細胞、NK細胞產生。由于ASFV主要的靶細胞是單核/巨噬細胞，IFN-γ可能對ASFV與宿主細胞的相互作用產生直接影響，特別是在病毒感染的早期階段。早在1988年，有文獻報道，豬IFN-γ能在體外豬巨噬細胞中抑制ASFV的復制[37]。REVILLA等[38]用無毒的ASFV注射免疫近交系豬，然后分離外周血單核細胞(PBMC)，發現只有用同源或減毒的ASFV(Ba71v、Ba71、UGA 59)刺激時，才能產生IFN-γ，而用異源、強毒的ASFV(CC83、WH55)刺激時則不能產生。接種無毒的ASFV OURT88/3后再接種強毒OURT88/1豬的每百萬PBMC中能產生IFN-γ的淋巴細胞數量要比單獨接種OURT88/3的多，并且與免疫保護有良好的相關性[39]。隨后通過交叉保護試驗證明，當免疫后豬的PBMC用其他基因Ⅰ型毒株(Benin 97/1)刺激時，可以檢測到高水平IFN-γ，Lisbon 57則不產生；而用基因Ⅹ型烏干達分離株刺激時則產生很高水平IFN-γ。通過免疫保護試驗發現，所有能夠產生IFN-γ的免疫豬能夠抵抗烏干達強毒分離株的感染[39]。這些結果表明，IFN-γ與ASFV的免疫保護有很好的相關性。

3 ASFV與細胞凋亡

細胞凋亡是宿主抵抗病原體的重要防御機制，具有限制病原體復制和傳播的作用，是天然免疫的重要組成部分。許多病毒已經進化出多種抗細胞凋亡機制。ASFV編碼多種抗宿主細胞凋亡的蛋白，可抑制感染細胞的凋亡。

ASFV的A179L蛋白是一種B細胞淋巴瘤2樣蛋白(Bcl-2)，包含與BH3蛋白家族結構域相似的所有結構域，可以抑制Bax和Bak的激活，進而通過抑制細胞色素C的釋放和凋亡酶激活因子1(APAF1)/細胞色素C復合物的形成以及Caspase級聯反應的激活，從而抑制宿主細胞凋亡[40-41]。A179L蛋白在ASFV感染細胞后的早期和晚期都表達，但沒有包裝到病毒顆粒中。這表明A179L可能在整個感染過程中均參與抑制細胞凋亡，但并未參與病毒核心進入細胞質的最早階段[13,42]。

ASFV的A224L蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員，并含有BIR基序。在感染了刪除A224L基因的ASFV的細胞中，觀察到Caspase 3活性增加，說明A224L可抑制Caspase 3的激活，從而抑制細胞凋亡。A224L的表達可激活NF-κB，通過激活許多抗凋亡基因(包括IAP和Bcl-2家族成員)的轉錄抑制細胞凋亡。A224 L蛋白是ASFV晚期表達蛋白，被包裝到病毒顆粒中，在病毒感染的前期和后期均具有潛在作用[43-44]。與親本株相比，刪除A224L基因的ASFV強毒株在豬巨噬細胞中的復制并沒有變化，毒力也沒有降低[45]，NH/P68Δ224L-COS7卻能提供一定強毒攻擊保護，雖然在感染后期，實驗動物出現了胃、肝、腎、淋巴結中度腫大和部分出血，心包積水等亞臨床癥狀[29]。說明ASFV在體內抑制宿主細胞凋亡并不是通過單一蛋白完成，可通過其他多個基因協作彌補A224L的缺失。

ASFV的DP71L蛋白可以靶向性地使真核翻譯起始因子2α(eIF-2α)去磷酸化，抑制促凋亡轉錄因子CHOP的激活，從而抑制內質網應激介導的細胞凋亡[46-47]。分別刪除ASFV Malawi Lil20/1和 ASFV E70中DP71L基因，然后用重組毒感染豬巨噬細胞，發現不會引起細胞eIF2α磷酸化水平的增加或CHOP的誘導，這表明DP71L不是ASFV在感染過程中控制eIF2α磷酸化水平所需的唯一基因[47]。DP71L可能不是某些ASFV毒力所需，分別從ASFV Malawi Lil20/1和ASFV Pretoriuskop/96/4中刪除全長的DP71L和截短DP71L基因，對家豬的毒力沒有影響[48]。相反，從ASFV E70中缺失或截短DP71L基因可導致毒力減弱[49]。這可能是ASFV E70自然缺失了其他一些基因，而這些基因可以補償DP71L的缺失所造成的影響。

ASFV可通過多種機制抑制感染細胞的凋亡，但是在感染的后期可以觀察到被感染細胞的凋亡。通過這種方式促進病毒在凋亡小體中的擴散和單核細胞/巨噬細胞吞噬病毒，從而避免被感染細胞的壞死引起的炎癥反應。在體內也可觀察到受感染的單核細胞/巨噬細胞的凋亡。急性ASF的主要特征是引起淋巴組織和血液中未受病毒感染的B、T淋巴細胞大量凋亡。初級和次級淋巴器官中的淋巴細胞消耗以及非淋巴器官(例如肝和腎)中淋巴細胞的死亡均歸因于淋巴細胞的大量凋亡，但是誘導未感染淋巴細胞凋亡的機制還不清楚[50-52]。被感染的巨噬細胞周圍淋巴細胞強烈凋亡，這表明被感染的細胞可能分泌或細胞表面表達某些因子，從而誘導未感染的淋巴細胞凋亡，TNF-α就是一種可能的參與因子[18,53]。由凋亡引起的淋巴細胞的大量死亡可能也是免疫抑制的一種機制，有利于ASFV在體內復制。

4 ASFV與炎癥反應

ASFV可以抑制巨噬細胞M1極化，抑制機體炎癥反應。研究人員通過比較蛋白質組學研究發現，弱毒株E75CV1調節了涉及宿主炎癥反應的多個蛋白的表達[54]。ASFV的A238L蛋白與NF-κB轉錄因子的抑制物I-κB具有相似的結構，因此A238L蛋白可以抑制NF-κB的活化，從而抑制NF-κB信號通路誘導的炎癥反應[55]。A238L蛋白還能夠結合鈣調蛋白磷酸脂酶(CaN)并抑制其作用，從而抑制了活化T細胞核因子(NFAT)活化[20]，進而抑制宿主的炎癥反應[56]。A238L在感染了ASFV的Vero細胞或巨噬細胞中可有效地抑制TNF-α的產生，說明A238L蛋白是一種強效的抗炎蛋白[57-58]。研究人員應用酵母雙雜交試驗發現，ASFV的I83L蛋白能與IL-1β結合，并且預測I83L蛋白可能在調控IL-1β促炎活性方面起作用[59]。

5 ASFV與天然免疫細胞

自然殺傷細胞(NK cell)是先天免疫系統的重要細胞組成成分，能夠殺死感染了病原體的細胞和惡性腫瘤細胞，是IFN-γ和TNF-α的重要來源[60]。研究人員將感染ASFV NH/P68的豬與未感染的對照組相比，發現感染后7 d豬的NK細胞活性明顯增加，而在感染后7～28 d，沒有臨床癥狀的接毒豬NK細胞水平顯著性增高。試驗中無臨床癥狀的豬能夠經得住ASFV Lisbon 60致死性攻擊。這一結果表明，NK細胞的激活能夠減輕ASFV分離株引起的臨床癥狀，有效誘導保護性免疫[61]。相反，接種中等毒力Malta 78 ASFV分離株的6頭豬中，有4頭豬在接毒后3～6 d NK細胞活性出現明顯抑制[62]。令人感興趣的是，研究人員發現，在體外40℃培養時，NK細胞活性喪失，因此，豬患ASF后，體溫升高可能是NK細胞活性降低的原因。另一方面， ASFV在體外可以抑制NK細胞的活性[63]。NK細胞的活性有可能與ASFV的毒力相關，因為從健康豬體內分離的外周血淋巴細胞(PBMC)中的NK細胞活性可被無毒的NH/P68 ASFV激活，但被有毒的Lisbon 60 ASFV抑制[64]。綜上所述，NK細胞至少能夠對非致病性ASFV做出有效地反應。

ASFV主要的靶細胞是單核細胞/巨噬細胞，但也可以感染樹突狀細胞(DC)等抗原呈遞細胞并在其中復制。有研究表明，將豬的γδ T細胞與ASFV共同孵育后，γδT細胞可將ASFV遞呈給特異性T細胞[65]。豬γδT細胞可以分泌IFN-γ等細胞因子和趨化因子，可能在ASFV感染過程中發揮作用，但其具體機制還需要進一步研究[65]。

6 小結與展望

ASF對于家豬和野豬是一種毀滅性的疾病，目前還沒有商用疫苗預防該病。雖然在ASFV與宿主的相互作用以及逃避宿主免疫反應研究方面已經取得了一定進展，但仍有許多問題需要深入研究。關于樹突狀細胞感染在發病和免疫反應中的潛在作用，目前尚缺乏資料。非易感細胞的感染障礙也不清楚。ASFV蛋白質組圖譜繪制成功后，為進一步研究病毒和宿主相互作用奠定了基礎，這將為研發疫苗或發展其他控制感染策略提供更多的幫助。

ASFV與宿主天然免疫系統的相互作用過程相當復雜，隨著研究的深入，人們對宿主抗ASFV機理和ASFV如何逃避宿主天然免疫系統防御有了一些認識，但宿主抗ASFV天然免疫反應的調控網絡還未完全闡述清晰。ASFV基因組左右可變區內存在大量屬于不同多基因家族(MGFs)的基因，其中MGF360和MGF505/530已被證明是ASFV毒力決定因素，并通過抑制Ⅰ型IFN誘導或Ⅱ型IFN反應發揮作用(表1)。然而，這些蛋白的作用機制還不清楚，單個基因的功能還不明了。此外，I329L作為TLR3信號的激動劑，需要進一步研究其在感染細胞和宿主的作用機制。目前，A179L已被證明是ASFV抑制細胞凋亡的一個主要基因，但還沒有獲得刪除A179 L基因的重組病毒，以確定其抑制凋亡的機理，這些都需要進行深入、系統的探究，從而為開發疫苗和抗病藥物提供新的思路和策略。

表1 ASFV基因在調控宿主天然免疫系統中的功能