5個綿羊群體ESR2基因多態性與產羔數的關聯分析

邵順成，閆背背，張天聞，梁 鵬，鄒詩凡，李新海，馮登偵 (寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750000)

我國綿羊品種豐富，但多羔品系較少，為了適應現代養羊業生產的需求，必須要有完整的良種繁育體系，利用現代生物技術手段，提高品種的利用價值。傳統育種方法獲得遺傳進展的速度緩慢，而利用標記性輔助選擇可以進行早期選種，從而提高選擇強度及效率。利用分子標記手段對綿羊進行選育，培育出多羔和具有優良生產性能的綿羊品種(系)的任務仍十分必要。

雌激素是動物體內重要的激素之一，參與了免疫、神經、內分泌和心血管等系統的功能調節，有多種生理作用，但要結合相應的受體才能發揮其生物學作用。雌激素受體(estrogen receptor,ESR)屬轉錄因子核受體超家族成員，主要由經典的ESR1、ESR2以及新型的G蛋白耦聯雌激素受體1(GPER1)組成。ESR1又叫ERα，其通過與雌激素結合，形成配體遷移至細胞核，結合特定的反應元件來調控轉錄過程，從而在相應的靶組織表達調控[1]。ESR2基因首次在大鼠的前列腺組織中發現，主要在前列腺的上皮細胞和卵巢顆粒細胞中表達， ESR2蛋白與ESR1蛋白DNA結構域同源性為95%，配體結合域同源性為55%，因具有高度的同源性，故將該蛋白命名為ERβ[2]。綿羊ESR2基因位于7號染色體，共編碼527個氨基酸，屬于非跨膜蛋白，廣泛表達于全身各組織，如：子宮、卵巢、結腸、前列腺、肺和膀胱等[3]。研究發現ESR2基因在卵泡形成和排卵中起關鍵作用，若敲除小鼠ESR2基因外顯子4區域，可抑制小鼠排卵，原因是外顯子4區域含有DNA結合域，DNA結合域對卵泡成熟和排卵有著至關重要的作用[4]。研究表明，ESR2基因可以調控動物的繁殖性狀，如ESR2在家禽卵巢中表達量與產蛋性能有一定的關聯性[5-6]；同時ESR2基因也被證實是調控豬高產仔數的基因之一[7-8]。近年來，國內外學者研究發現，ESR2基因也是影響綿羊多產的候選基因之一，使用ESR2進行標記輔助選擇可增加綿羊的產仔數，對養羊業具有重要的經濟價值[9]。

本試驗以杜泊羊、灘寒羊、雜一代、雜二代和橫交一代5個綿羊群體為研究對象，基于Ensembl數據庫中已有的ESR2基因的錯義突變位點，通過 Sequenom Mass ARRAY?SNP 技術對5個綿羊群體ESR2基因g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3個位點進行檢測，并進行產羔數關聯分析；利用相關生物信息學工具對突變前后二級結構和蛋白互作等進行分析與預測，以期為進一步研究綿羊ESR2基因的生物學功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料共采集5個綿羊群體共768只綿羊的血樣，其中有產羔數記錄的599只(表1)，各群體血緣比例關系見表2。受試羊群均為母羊，購自寧夏宇泊科技有限公司。所有羊只進行頸靜脈采血5 mL，加入EDTA-K2抗凝真空采血管 (江蘇宇力醫療器械有限公司)中，-20℃保存。同時記錄各群體母羊的產羔季節、胎次與產羔數。

表1 試驗羊群信息

表2 各群體血緣比例關系

1.2 綿羊基因組DNA提取使用血液DNA提取試劑盒(北京天根科技有限公司)對綿羊血液樣本DNA進行提取，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測5個綿羊群體血液DNA的純度、濃度和完整性。

1.3 基因分型采用Mass ARRAY Assay Design 3.1軟件設計檢測ESR2基因3個位點的單堿基延伸引物和聚合酶鏈式反應程序。

1.5 生物信息學分析通過SOPMA工具(http://npsaprabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)分析ESR2蛋白的二級結構；運用STRING數據庫(http://string-db.org/)，設置為高置信度0.7，構建與綿羊ESR2蛋白相互作用的蛋白質網絡。

2 結果

2.1 ESR2基因3個位點在5個群體中的分型結果由圖1可見，ESR2基因g.73323973C>T位點在D、F1、F2、H1、TH 5個群體中有CC、TC和TT 3種基因型；g.73353489C>A位點在D、F1、F2、H1、TH 5個群體中有CC、CA和AA 3種基因型；g.73326795G>A位點在5個群體中有AA、GA和GG 3種基因型。

g.73323973C>T g.73326795G>A g.73353489C>A圖1 ESR2基因3個位點在5個群體中的分型結果

2.2 5個群體ESR2基因不同位點的基因多態性分析ESR2基因g.73323973C>T位點在5個群體中均表現為中度多態；該位點在5個群體中的優勢等位基因為C，除在D群體中的優勢基因型為TC，在其他4個群體中的優勢基因型為CC；各群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。g.73353489C>A位點在5個群體中均表現為中度多態；各群體優勢等位基因均為C，優勢基因型為CC；該位點除D羊群體外，在其他4個群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。g.73326795G>A位點在TH群體中表現為低度多態，在D、F1、F2、H1群體中表現為中度多態；該位點在5個群體中的優勢等位基因為A，除在D群體中的優勢基因型為AG，在其他4個群體中的優勢基因型為AA；各群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

2.3 ESR2基因3個位點各基因型與5個綿羊群體產羔數的關系對ESR2基因3個位點的不同基因型與5個群體產羔數進行關聯分析，結果表明，g.73323973C>T位點在TH群體中與產羔數有一定的關聯性，其中TT型產羔數顯著高于TC、CC型(P<0.01)，說明g.73323973C>T位點適用于TH群體多羔性狀的選育。g.73326795G>A、g.73353489C>A 2個位點各基因型之間產羔數差異均不顯著，不適用于5個綿羊群體多羔性狀的選育，詳情見表4。

表3 ESR2基因3個位點在5個群體中的群體遺傳結構分析

表4 ESR2基因不同位點各基因型產羔數的關聯分析

2.4 生物信息學分析

2.4.1綿羊ESR2基因編碼蛋白二級結構的分析 用SOPMA在線工具預測其二級結構，結果表明參考蛋白二級結構α-螺旋(alpha helix)占35.29%，無規卷曲(random coil)占53.13%，延伸鏈(extended strand)占8.16%，β-轉角(beta turn)占3.42%。而位點g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3個位點的突變導致ESR2蛋白的 α-螺旋、β-轉角、無規卷曲和延伸鏈均發生了改變。

表5 蛋白質突變前后二級結構預測分析 %

2.4.2綿羊ESR2蛋白相互作用 運用STRING數據庫(http://string-db.org/)，設置為高信度0.7，構建與綿羊ESR2蛋白相互作用的蛋白網絡(圖2)。結果顯示，與ESR2蛋白相互作用的蛋白主要為NCOA家族、MAPA家族、SP1、NCOR1、SRC等相關蛋白。

圖2 綿羊ESR2蛋白的互作圖

3 討論

雌激素受體是配體依賴的轉錄調節因子，屬于配體激活轉錄因子中的一種核酸受體，不僅參與動物的繁殖性狀，研究發現雌激素受體還參與相關病理活動，如心血管疾病、癌癥等，故在診療技術方面的研究有很大的潛力[10-11]。ANTONSON等[12]通過基因編輯技術敲除了小鼠ESR2基因，發現缺乏ESR2基因的母鼠繁殖率較低，并且可導致后代不育。同時發現ESR2基因完全喪失會導致母鼠卵巢變小，使卵泡的成熟及排卵均受到影響[13]。研究發現雌激素受體在牛卵泡顆粒細胞中表達水平隨著卵泡的發育，其表達量逐漸降低，故ESR2基因可能對牛的卵泡發育與排卵起重要作用[14]。國內外學者對豬ESR2基因研究頗多，發現ESR2基因是影響豬產仔的主效基因之一，高天等[15]發現ESR2基因的外顯子1的A221G位點與嘉興黑母豬的產活仔數、總產仔數、初生均重以及死胎數顯著相關，為篩選母豬種群的高繁殖基因提供重要分子標記。自Fecb基因已被證實可以提高綿羊的產羔數，為綿羊分子育種提供了重要分子標記手段，所以繼續發掘與綿羊多羔相關的主效基因是國內外學者研究的熱點。ESR2基因作為影響動物繁殖性狀的基因之一，在綿羊上的研究也逐漸增多，如田志龍等[16]發現ESR2基因g.73324006C>T位點多態性與小尾寒羊前3胎產羔數及平均產羔數均顯著關聯，其中CC基因型各胎產羔數均高于TC基因型，并且ESR2基因在單羔小尾寒羊的垂體表達量顯著高于多羔小尾寒羊的垂體。

本研究團隊初期對灘羊、小尾寒羊、杜泊羊和灘寒羊為研究對象，利用飛行質譜法技術對ESR2基因10個錯義突變位點進行分型檢測，探究不同品種綿羊ESR2基因的遺傳結構，以期篩選出影響綿羊高繁殖力的關鍵位點，為綿羊選育提供分子標記。結果顯示g.73323973C>T與g.73326795G>A位點在杜泊、小尾寒羊和灘寒羊中A基因頻率極顯著高于灘羊(P<0.01)，所以這2個位點可能是影響綿羊產多羔的候選位點；g.73353489C>A位點的T基因頻率在杜泊羊群體極顯著高于小尾寒羊、灘羊、灘寒羊(P<0.01)，可作為杜泊羊繁殖性狀選擇的候選基因[17]。基于此，本試驗以5個綿羊群體為研究對象，對ESR2基因的3個多態位點展開研究，發現其同樣具有多態性。表型數據的關聯對分子標記育種起著至關重要的作用，產羔數關聯分析發現g.73323973C>T位點在灘寒羊群體中，TT基因型產羔數極顯著高于TC和CC基因型(P<0.01)，表明g.73323973C>T位點突變后可能會引起灘寒母羊排卵數增加。同時在H1群體中發現，該位點突變后，TT基因型產羔數均高于TC和CC基因型產羔數，但因H1群體TT基因型母羊樣本量較少，故后期要增加樣本量，再次進行關聯分析。

本研究的3個位點都屬于錯義突變位點，其突變前后均會引起氨基酸的改變。生物信息學分析發現3個位點突變前后蛋白質的二級結構類型均發生了變化，結構的變化導致功能的變化。其中3個位點突變后均導致α-螺旋比例降低，使其穩定性降低。蛋白互作網絡發現該基因編碼的蛋白主要與核受體輔激活蛋白 (nuclear receptor coactivator,NCOA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等蛋白互作。其中NCOA蛋白又稱為類固醇受體輔激活蛋白，可以調節多種轉錄因子的活性，會影響黃體的生成，NCOA1基因也被證實為動物繁殖性能候選基因之一[18-19]。從蛋白互作發現ESR2蛋白與多種信號通路中蛋白進行互作，參與多種生理調控，但其互作網絡調控作用的相關機制有待深入研究。本研究為進一步探討將ESR2基因應用到多羔綿羊品系的培育中提供相關遺傳信息基礎。