基于網(wǎng)絡藥理學探討半夏-厚樸藥對治療癲癇的作用機制研究

楊燕， 任娟， 汪澤， 曹永軍， 王朝群， 何希瑞

癲癇是由大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導致大腦短暫功能障礙的一種慢性疾病。全球約有6 000萬左右的癲癇患者，且以每年240萬病患人數(shù)遞增[1]。經(jīng)2～5年的規(guī)范治療，臨床上仍有約30%的患者對現(xiàn)有藥物產(chǎn)生了耐藥性[2-4]。癲癇患者由于長期大量使用抗癲癇藥物，產(chǎn)生諸多不良反應，嚴重影響生活質(zhì)量，帶來嚴重經(jīng)濟負擔，成為醫(yī)療衛(wèi)生領域的重大難題[5-6]。其中，兒童癲癇的發(fā)病機制與形式更為復雜、多樣[7]，其治療成為醫(yī)療衛(wèi)生領域的重大難題。

中醫(yī)理論認為癲癇證候繁多，病因復雜。歸納起來，可分為痰、火、風、驚、血瘀、外傷等多種病因。其中，痰和火是癇病的主要病因[8]。半夏-厚樸作為相須相使藥對，出自《金匱要略》記載的半夏厚樸湯，具有行氣散結，降逆化痰之功效。藥對中半夏辛溫入肺胃，化痰散結，降逆和胃，主要用于痰飲眩悸，風痰眩暈，痰厥頭痛等癥。據(jù)統(tǒng)計，350首中醫(yī)治療癲癇的方劑中，半夏位于單味藥物使用頻率的第四位[9]。厚樸苦辛性溫，下氣除滿，具有化濕導滯、化食消痰、驅(qū)風鎮(zhèn)痛之效。方中厚樸助半夏散結降逆。研究發(fā)現(xiàn)，主要包含半夏和厚樸的組方能顯著降低癲癇大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體1 mRNA的表達，上調(diào)γ-氨基丁酸受體A基因及γ-氨基丁酸受體的表達[10]。鄧中甲教授運用半夏厚樸湯治療失眠、驚悸、眩暈、脅痛等癥屬膽郁痰擾者，以及癲癇等癥見痰氣交阻者的臨床效果顯著，表明半夏及其配伍在治療癲癇疾病方面具有研究價值[11]。由于半夏和厚樸配伍后具有多成分、多靶標、多途徑等特點，故其抗癲癇的藥效物質(zhì)基礎及作用機制較難闡明。

網(wǎng)絡藥理學是分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶標、多途徑”協(xié)同作用關系的藥理學分支學科，其整體性、系統(tǒng)性等特點與中醫(yī)藥整體觀及辨證論治原則一致，為研究中藥或復方有效成分、作用靶點、潛在機制等提供有效研究策略[12-14]。鑒于此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，篩選半夏厚樸防治癲癇的主要有效成分、潛在作用靶標，構建“藥物-有效成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡，進行潛在靶標富集分析，探討其潛在作用機制，為后續(xù)的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，小分子數(shù)據(jù)庫PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，蛋白質(zhì)三維結構數(shù)據(jù)庫(http://www.rscb.org/)，網(wǎng)絡分析軟件Cytoscape(Version 3.6.0)，化學分子結構軟件ChemBioDraw(Version 14.0)，分子對接軟件MOE(Version 2019)。

1.2 潛在有效成分數(shù)據(jù)庫的構建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集半夏-厚樸藥對化學成分，并結合CNKI數(shù)據(jù)庫中已報道的半夏、厚樸相關文獻，構建半夏-厚樸成分數(shù)據(jù)庫。按照口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18為條件進行初步篩選[15-16]，得到半夏-厚樸藥對抗癲癇的潛在有效成分。

1.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡模型的構建 為了闡明半夏-厚樸的防治癲癇的分子機制及其與相關靶點之間的對應關系，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法對其進行分析，得到半夏-厚樸藥對主要有效成分及其關鍵作用靶點。將1.2中得到的半夏-厚樸潛在有效成分及其對應靶點做成對應的關系表，即C-T.xlsx。然后將該表導入Cytoscape軟件，構建“成分-靶點”(C-T)網(wǎng)絡模型，分別用不同顏色、形狀的節(jié)點表示半夏-厚樸藥對的潛在有效成分及作用靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集、生物過程富集分析 為了研究靶點蛋白在整體層面的相互作用，并更好地理解半夏-厚樸藥對的防治癲癇的作用機制，將1.3得到的半夏-厚樸藥對靶點信息匯總，保存為txt形式文件，并導入STRING在線分析平臺中，選取打分值>0.7(高置信度)作為過濾器，得到半夏-厚樸藥對的靶點相互作用網(wǎng)絡模型，并通過STRING 11.0的Analysis模塊進行KEGG富集與生物過程分析。

1.5 分子對接 將網(wǎng)絡藥理學預測得到的半夏、厚樸潛在有效成分的化學結構轉(zhuǎn)換為sdf格式，并對其進行加氫及能量優(yōu)化，用于進一步對接。從蛋白晶體數(shù)據(jù)庫(PDB)中下載過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)-α,PPAR-γ的三維晶體結構。用MOE軟件對蛋白結構進行結構處理，刪除多余水分子，然后進行能量優(yōu)化。將半夏、厚樸潛在活性化學分子與PPAR-α,PPAR-γ進行對接打分，利用Dock模塊進行半柔性對接。對接允許配體分子中化學鍵旋轉(zhuǎn)，選擇打分函數(shù)為GBVI/WSA dG。打分函數(shù)表征了配體與受體的結合程度，打分值越小，表明配體-受體結合越穩(wěn)定。

2 結果

2.1 半夏-厚樸藥對抗癲癇有效成分 本研究通過系統(tǒng)藥理學分析平臺、CNKI數(shù)據(jù)庫共收集到半夏、厚樸的化學組分共259個。通過對這些化合物進行口服生物利用度及類藥性的分析與篩選，得到潛在有效成分共15個(BX1～BX13，HP1，HP2)。化合物的編號、名稱、分子量及參數(shù)見表1。

表1 篩選化學成分及口服生物利用度

2.2 半夏-厚樸藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡模型及其分析 為了解釋半夏-厚樸藥對的抗癲癇作用機制，將上述15個潛在有效成分通過TCMSP計算平臺進行靶點預測與分析，得到半夏-厚樸藥對的靶點數(shù)55個，其中5個半夏成分(BX4,BX8,BX10,BX12,BX13)沒有得到預測靶點信息。通過Cytoscape軟件構建半夏-厚樸中10個潛在有效成分與55個靶點之間的“成分-靶點”網(wǎng)絡對應關系圖，進一步闡明半夏-厚樸抗癲癇作用的關鍵有效成分、關鍵靶點及其相互對應關系(圖1)。

圖1中的“成分-靶點”網(wǎng)絡共包含65個節(jié)點，分別由10個潛在有效成分和55個靶點組成。如圖1所示，“成分-靶點”網(wǎng)絡圖中分別用不同形式的節(jié)點代表半夏-厚樸藥對的潛在有效成分及相應的靶點。其中，藍色菱形節(jié)點表示半夏-厚樸藥對中經(jīng)口服生物利用度、類藥性篩選得到的潛在有效成分，黃色圓形節(jié)點代表潛在有效成分群對應的靶點。在圖1中，潛在成分對靶蛋白群的作用程度可以用節(jié)點的“度”來刻畫，度越高表示該成分能夠作用于更多的靶點，即該成分可以更多地參與到有機體的病理或生理過程。類似的分析也可以用于靶點，即靶點的度越高，它與藥物作用網(wǎng)絡的關系更加密切。進一步對半夏-厚樸藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，黃芩素(BX3)、廿碳-11-烯酸(BX7)、β-谷甾醇(BX5)的中心度較高(黃芩素的中心度為22，廿碳-11-烯酸的中心度為10，β-谷甾醇的中心度為9)。

圖1 半夏-厚樸藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡圖

2.3 KEGG通路分析 通過富集分析可以獲得靶點基因的相關生物學功能。本研究利用STRING在線分析平臺，對半夏-厚樸抗癲癇的關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)共有10條代謝通路(圖2)，分別是PPAR、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁的分泌等代謝通路。半夏-厚樸藥對參與的生物過程如圖3所示，主要有脂肪代謝、類固醇激素代謝、脂肪轉(zhuǎn)運、細胞應答，激素應答，小分子代謝及有機陰離子轉(zhuǎn)運等過程。這些生物過程參與癲癇的發(fā)生與發(fā)展，同時也受到癲癇疾病發(fā)作的影響。對脂肪代謝和類固醇激素代謝途徑的干預對難治性癲癇如Dravet綜合征和熱性驚厥的臨床治療具有重要意義和潛在臨床應用價值。

圖2 KEGG通路富集分析半夏-厚樸藥對有效成分抗癲癇的核心靶標

圖3 Biological Process富集分析半夏-厚樸藥對有效成分抗癲癇的相關生物過程

2.4 半夏-厚樸藥對靶蛋白群相互作用分析 為了研究半夏-厚樸藥對與靶蛋白之間的相互關系，我們對其治療癲癇相關的靶點群進行了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡構建，得到圖4。如圖4所示，半夏-厚樸藥對治療癲癇的核心靶點之間存在明顯的協(xié)同相互作用關系。結合“成分-靶點”作用網(wǎng)絡分析可以發(fā)現(xiàn)，半夏-厚樸藥對抗癲癇的潛在有效成分與核心靶點蛋白之間存在協(xié)同效應，這種相互間協(xié)同作用改善了大腦的能量代謝和酮體代謝之間的聯(lián)系，產(chǎn)生協(xié)同增效的抗癲癇作用。

圖4 作用靶點的相互作用網(wǎng)絡

2.5 網(wǎng)絡的拓撲分析和模塊分析 為了明確半夏-厚樸藥對抗癲癇的關鍵有效成分及主要的作用靶點，本研究篩選到的潛在有效成分及其對應的靶點進行網(wǎng)絡拓撲分析。在得到的“成分-靶點”網(wǎng)絡基礎上，進一步利用Cytoscape軟件中的Network Analysis模塊對網(wǎng)絡進行拓撲分析，獲取拓撲參數(shù)。網(wǎng)絡中節(jié)點的中心度可以用節(jié)點與節(jié)點之間相互作用的路線數(shù)目來表征。例如，節(jié)點中心度等于1表示該節(jié)點只與網(wǎng)絡中一個靶點發(fā)生相互作用。節(jié)點的度越高，其代表的潛在有效成分或靶點在網(wǎng)絡中相互作用的參與度越高。表2列出了半夏-厚樸藥對中潛在有效成分作用靶點的拓撲參數(shù)列表。

表2 “成分-靶點”網(wǎng)絡的拓撲分析

2.6 分子對接 本研究采用MOE對接模塊的半柔性對接模塊對PPAR靶點和半夏、厚樸的潛在有效成分逐一進行分子對接，選取打分排名靠前的化合物表征，打分見表3。本研究選用GBSI/WSA dG函數(shù)作為打分函數(shù)，該打分函數(shù)準確性高，可以更好的評估藥物分子與靶點間的結合能。打分函數(shù)描述了小分子與靶點間的結合能，其值越低說明配體與受體之間的相互作用越強。從表3可以看出，半夏中成分BX7，BX9，BX10與PPAR-α的對接打分分別為-9.378 3，-9.315 5，-9.076 9，與對照藥打分值(-9.654 9)相近，說明半夏中這些有效成分與PPAR-α有較強的相互作用，可能是半夏發(fā)揮藥理作用的靶點之一。同時，半夏中成分BX7，BX10與PPAR-γ的打分值為-8.923 7，-8.768 6，與對照藥打分(-9.099 1)接近，說明這些化合物可能半夏抑制PPAR活性的成分。圖5和圖6分別顯示了半夏有效成分BX8與PPAR-α和PPAR-γ間的相互作用。PPAR-α的Cys276、Met330、Met335與BX8形成3對氫鍵，穩(wěn)定了BX8與PPAR-α的相互結合。另外，PPAR-γ的Tyr473、His323、Arg288也可以與BX8形成3對氫鍵，從而穩(wěn)定它們之間的相互作用。

表3 半夏-厚樸藥對有效成分-核心靶點分子對接

圖5 半夏-厚樸藥對有效成分BX8-核心靶點分子PPAR-α(PDB:3VI8)對接模式圖

圖6 半夏-厚樸藥對有效成分BX8-核心靶點分子PPAR-γ(PDB:3VJH)對接模式圖

3 討論

癲癇影響全球1‰～2‰的兒童和0.5‰～1‰的人口。盡管診斷準確且使用抗癲癇藥物進行了規(guī)范治療，仍有大約30%的癲癇患者未得到有效治療或?qū)ΜF(xiàn)有藥物產(chǎn)生了耐藥性，嚴重威脅著人類的健康[1-2,7-8]。研發(fā)安全高效的新型抗癲癇藥物是癲癇學界研究的熱點和難點問題[3-4]。明代《醫(yī)學綱目·癲癇》將癲癇總結為“痰邪逆上也，孔竅不通，故耳不聞聲，目不識人，而昏眩倒仆也”，認為癲癇病以痰為主，每由風、火觸動。中醫(yī)藥治療癲癇具備多組分、多靶點、整體調(diào)節(jié)且不良反應少的優(yōu)勢，可有效提高患者的生活質(zhì)量。半夏厚樸湯出自《金匱要略》，是治療情志不暢，痰氣互結所致梅核氣的常用方。方中君藥半夏苦辛溫燥，化痰散結，降逆和胃，臣藥厚樸苦辛而溫，行氣開郁，下氣除滿。兩藥為伍，行氣滯化痰結，共奏降逆化痰之功。近年來，實驗研究或臨床觀察均證實半夏及半夏-厚樸藥對對癲癇具有一定的療效[10-11]，但對其抗癲癇的主要有效成分與作用機制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡藥理學對半夏-厚樸藥對抗癲癇的有效成分和作用機制進行預測，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對抗癲癇的主要有效成分為黃芩素、黃芩苷、松柏苷、(E)-11-二十烯酸和桉葉油醇等。其中，化合物黃芩素和黃芩苷均被報道具有明顯的抗癲癇作用。特別是，黃芩苷可顯著抑制氯化鋰-匹羅卡品、戊四唑、紅藻氨酸致癲癇模型動物癲癇發(fā)作次數(shù)，提高海馬神經(jīng)元自噬活性、減少神經(jīng)元的凋亡與壞死，從而減輕癲癇所致大腦損傷[17-18]。臨床研究顯示，黃芩苷可顯著降低癲癇患者血清S100β和神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量，降低大腦神經(jīng)損傷，防止癲癇發(fā)作[19]。松柏苷的結構與司替戊醇較類似，后者是臨床上用于治療2歲及以上服用氯巴占的患者與Dravet綜合征相關的癲癇發(fā)作[20-22]。半夏-厚樸藥對中其他幾個抗癲癇有效成分的抗癲癇活性研究尚處于空白階段。

通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對共有10條代謝通路，分別是PPAR、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁的分泌、細胞間隙連接、葉酸合成、脂肪的消化與吸收等代謝通路。其中，半夏-厚樸藥對對PPAR信號通路的影響最為顯著。PPAR可通過調(diào)節(jié)氧化應激、炎癥反應、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/酪氨酸激酶受體B或能量代謝在癲癇發(fā)作中發(fā)揮保護作用，是治療癲癇最重要的藥物靶標之一[23-24]。動物實驗表明，PPAR-α或PPAR-γ選擇性激動劑可顯著提高癲癇發(fā)作閾值，提示PPAR可能參與了癲癇的控制[23]。類固醇激素作為治療癲癇的藥物之一，對其中一部分難治性癲癇具有良好療效[25-27]。特別是神經(jīng)類固醇激素如性激素和皮質(zhì)激素與突觸可塑性關系密切，參與癲癇的發(fā)病，也受癲癇發(fā)作的影響[27]。花生四烯酸代謝通路與炎癥發(fā)生發(fā)展關系密切，而炎癥介質(zhì)可能既是癲癇的并發(fā)癥，也是某些癲癇發(fā)生的內(nèi)在誘因。如顳葉癲癇和皮質(zhì)發(fā)育不良導致的癲癇患者腦組織中存在白細胞介素-1β、白細胞介素-1受體1、白細胞介素-1和腫瘤壞死因子等大量的炎癥介質(zhì)[28-29]。脂肪的消化與吸收代謝通路與癲癇發(fā)生發(fā)展具有很高的關聯(lián)性。脂肪分解代謝產(chǎn)生的酮體在Dravet綜合征和熱性驚厥模型中顯示出顯著的抗癲癇作用，其可通過抑制谷氨酸能突出傳遞，激活ATP敏感鉀離子通道等途徑發(fā)揮抗癲癇活性[30]。本研究顯示，半夏-厚樸藥對通過影響這些與癲癇相關的代謝通路而發(fā)揮多靶標、多通路的協(xié)同增效作用。“成分-靶點”網(wǎng)絡顯示半夏-厚樸藥對有效成分治療癲癇的主要靶標有PPAR，細胞色素P450 19A1、睪丸特異性雄激素結合蛋白等。考慮到PPAR是生酮飲食療法治療難治性癲癇的重要機制之一，實驗選擇其作為核心靶標，通過分子模擬對接技術發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對關鍵有效成分與PPAR-α存在較強的相互作用關系。因此，未來針對半夏-厚樸藥對抗癲癇相關活性及機制研究，可優(yōu)先從PPAR著手。

綜上，本研究結果初步驗證和闡釋了半夏-厚樸藥對抗癲癇的有效成分和分子作用機制，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對在治療癲癇方面顯示出較強的臨床應用價值。半夏-厚樸藥對治療癲癇呈現(xiàn)多成分、多靶點、多通路的特性，闡釋了中藥配伍相須相使、協(xié)調(diào)增效的科學內(nèi)涵，為半夏-厚樸藥對的臨床應用提供理論參考，為后續(xù)深入研究半夏-厚樸藥治療癲癇的物質(zhì)基礎、有效成分的二次開發(fā)及藥理作用機制提供了思路和借鑒。