鵝肌肽對高尿酸血癥大鼠的干預(yù)作用研究

張雅琴 張召鋒 張維 蘇米亞·艾合買提江 葉晨 買熱排提·哈力木拉提

作者簡介：張雅琴（1994—），女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與疾病。

通信作者：張召鋒（1978—），男，博士，副教授，研究方向：營養(yǎng)與疾病、腸道菌群與慢性病。

摘要：目的：探討鵝肌肽對高尿酸血癥大鼠的作用及其機制。方法：選用雄性SD大鼠60只，隨機分為6組：空白對照組（CON）、高尿酸血癥組（HUA）、別嘌呤醇組[Allo：10 mg/（kg·d）]和鵝肌肽干預(yù)組[Ans 1 mg：1 mg/（kg·d）];[Ans 10 mg：10 mg/（kg·d）];[Ans 100 mg：100 mg/（kg·d）]，空白對照組喂養(yǎng)普通大鼠飼料，其他5組均喂養(yǎng)高尿酸血癥模型飼料，進行相應(yīng)物質(zhì)的灌胃，實驗周期為6周，實驗結(jié)束后，收集大鼠24 h尿量，評價大鼠尿酸和腎功能指標(biāo)，并進行腎臟組織學(xué)觀察。結(jié)果：與CON組相比，HUA組血尿酸水平顯著升高（P<0.05），血尿素氮、尿量及尿酸排泄指標(biāo)均有顯著性差異（P< 0.05）。與HUA組相比，鵝肌肽干預(yù)組中，Ans 10 mg和Ans 100 mg組的血尿酸水平降低（P< 0.05），尿量及尿酸排泄指標(biāo)有顯著性差異（P< 0.05），Ans 1 mg的胱抑素C和Ans 100 mg的血清腺苷脫氨酶顯著降低（P< 0.05）。組織學(xué)分析顯示，鵝肌肽各干預(yù)組大鼠管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡變性明顯改善，無纖維化，與空白對照組差異較小，能明顯延緩高尿酸血癥大鼠的腎臟損傷。結(jié)論：鵝肌肽能降低高尿酸血癥大鼠尿酸水平，可能是通過促進腎臟尿酸排泄和保護腎功能來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：高尿酸血癥;鵝肌肽;尿酸;排泄率

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的不斷改變，高尿酸血癥的患病率迅速上升并逐漸趨向低齡化[1-2]。高尿酸血癥不僅會增加痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險，還會增加糖尿病[3]、心血管疾病[4]、腎臟疾病[5]等多種疾病的患病風(fēng)險。然而，目前的藥物治療雖然降低尿酸效果明顯，但在長期使用過程中會產(chǎn)生如進行性腎功能衰竭、嚴(yán)重肝毒性[6-8]等副作用。咪唑類化合物（如鵝肌肽、L-組氨酸等）在脊椎動物的肌肉和大腦中高濃度存在[9]，其中，鵝肌肽（β-丙氨酰-1-甲基L-組氨酸）為多功能高度穩(wěn)定的水溶性組氨酸二肽[10]，主要是從金槍魚或鰹魚中提取獲得。鵝肌肽具有強大的排酸抗氧化功能[11-14]，但目前鵝肌肽對高尿酸血癥研究僅限于在斑馬魚中，對高尿酸血癥的作用機制仍不明確。因此，本研究擬通過建立高尿酸血癥大鼠模型，觀察鵝肌肽對高尿酸血癥模型大鼠的干預(yù)作用，旨在為研究高尿酸血癥的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物

選擇6～8 w齡雄性清潔級SD大鼠60只，體重（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證編號：SCXK（京）2016-0006，飼于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級動物飼養(yǎng)室，實驗開始前用普通飼料進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2造模材料及干預(yù)物質(zhì)

4%氧嗪酸鉀聯(lián)合20%的酵母制成的高尿酸血癥造模飼料，購于北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司。鵝肌肽：淡黃色粉末，一般從金槍魚等海魚或者鳥肌肉中分離提取獲得，購自國藥集團星沙制藥有限公司。黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司。別嘌呤醇：白色粉末，分子量為120（本項目研究中的別嘌呤醇純度為98%，購自北京百靈威科技有限公司）。

1.3動物分組、造模及干預(yù)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，利用隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為6組，每組10只。分別為：空白對照組（CON）、高尿酸血癥組（HUA）、別嘌呤醇組（Allo）和鵝肌肽干預(yù)組（Ans 1 mg、10 mg、100 mg）。空白對照組給予普通大鼠飼料喂養(yǎng)，其他5組給予高尿酸血癥造模飼料喂養(yǎng);Allo組大鼠給予10 mg/（kg·d）的別嘌呤醇灌胃，Ans 1 mg、Ans 10 mg、Ans 100 mg組分別給予1、10、100 mg/（kg·d）的鵝肌肽溶液灌胃，所有大鼠均自由飲水和進食，干預(yù)喂養(yǎng)6 w。

1.4樣品收集及指標(biāo)測定

1.4.1大鼠血清和尿液中尿酸、肌酐和尿素氮濃度的測定實驗結(jié)束時，大鼠禁食12 h，經(jīng)股動脈采血5 mL。靜置凝血30 min以上，使用離心機在4 ℃條件下以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，再取300 μL血清，使用全自動生化分析儀來測定血清尿酸（SUA）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、血清胱抑素C水平。飼養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠放置在代謝籠中，收集24 h的尿液，測量尿液體積，并測定尿尿酸（UUA）、尿肌酐（UCr）的值。

尿中尿酸清除率（CUA）、肌酐清除率（CCR）的計算方法如式（1）、（2）：

CUA=UUA/SUA×尿量（mL/min）（1）

CCR=UCr/SCr×尿量（mL/min）（2）

1.4.2血清及肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）、血清腺苷脫氨酶（ADA）活性測定取100 μL血清測定黃嘌呤氧化酶（XOD）活性，取50 μL血清，測定腺苷脫氨酶（ADA）活性。摘取各組大鼠肝臟，準(zhǔn)確稱取1 g，加入0.9%生理鹽水制成10%肝勻漿，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取100 μL上清液，利用比色法測定肝臟XOD活性。

1.4.3腎臟組織學(xué)觀察實驗結(jié)束后，處死大鼠，取大鼠右腎，用4%多聚甲醛固定，然后將腎臟組織包埋于石蠟切片中，制成3 μm切片，用蘇木精和伊紅染色，最后將這些切片置于光鏡（×400）下觀察并拍照分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。運用SPSS 25.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)先進行方差齊性分析，然后進行單因素方差分析;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足正態(tài)性或者方差齊性要求后進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到要求，采用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計，組間比較采用最小顯著差異法（LSD），以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1各組大鼠體重、進食量的變化

基線周各組大鼠體重?zé)o明顯差異（P>0.05），干預(yù)6 w后，與空白對照組相比，高尿酸血癥組體重明顯下降，別嘌呤醇組體重和高尿酸血癥組差異不大，鵝肌肽各干預(yù)組（Ans 1、10、100 mg）體重與空白對照組差異不大。實驗期間各組大鼠進食量均無明顯差異（P>0.05），提示鵝肌肽對高尿酸血癥大鼠的體重和進食量沒有影響（表1）。

2.2各組大鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平的變化

到實驗第6周末，與空白對照組相比，高尿酸血癥組大鼠的血尿酸水平顯著升高（P<0.05），顯示造模成功。同時高尿酸血癥組大鼠的血清尿素氮、肌酐水平與空白對照組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。別嘌呤醇組、鵝肌肽1 mg、鵝肌肽10 mg、鵝肌肽100 mg組較高尿酸血癥組都有一定程度的降低，其中，鵝肌肽10 mg組和鵝肌肽100 mg組降低最為明顯，分別降低了21.8、20.7 μmol/L（P<0.05）。與高尿酸血癥組相比，鵝肌肽各干預(yù)組大鼠血清尿素氮的水平無顯著性差異，但各組大鼠的血清肌酐值較高尿酸血癥組均降低，且鵝肌肽100 mg組血清肌酐降低的水平較高尿酸血癥組有顯著性差異（P<0.05）（表2）。

2.3各組大鼠尿酸排泄相關(guān)指標(biāo)

到實驗第6周末，與空白組相比，高尿酸血癥組尿量減少，CUA、CCR均明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與高尿酸血癥組相比，別嘌呤醇組尿量增加，CUA升高（P<0.05），鵝肌肽各干預(yù)組的尿量也明顯增加（P<0.05），CUA、CCR均明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.4各組大鼠血清中XOD、ADA活性、肝臟XOD活性及胱抑素C的值

到實驗第6周末，與空白組相比，高尿酸血癥組的血清XOD和血清ADA均升高（P<0.05），但胱抑素C和肝組織XOD并無顯著性差異。與高尿酸血癥組相比，鵝肌肽各干預(yù)組的血清和肝組織中的XOD的值均無顯著性差異，別嘌呤醇組、鵝肌肽100 mg組的血清ADA值降低（P<0.05），鵝肌肽1 mg組的胱抑素C水平降低（P<0.05）（圖1）。2.5大鼠腎臟組織的病理改變

空白對照組：大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，未見腎小管管腔擴張，且管腔清晰，腎小管上皮細胞形態(tài)飽滿，排列整齊，無炎癥及纖維化出現(xiàn)。與空白對照組相比，高尿酸血癥組腎小管管腔明顯擴張（箭頭1），腎小管上皮細胞見空泡變性（箭頭2），且排列雜亂，偶見炎性細胞浸潤，未見纖維化。與高尿酸血癥組相比，別嘌呤醇組腎小管管腔稍擴張，腎小管上皮細胞偶見空泡變性，排列較為整齊。鵝肌肽1 mg組腎小管管腔稍擴張，腎小管上皮細胞未空泡變性，排列較為整齊，但腎小管管腔間質(zhì)內(nèi)偶見成纖維細胞（箭頭3）。鵝肌肽10 mg組、鵝肌肽100 mg組大鼠管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡變性明顯改善，無纖維化，與空白對照組差異較小（圖2）。

3討論

本研究觀察了鵝肌肽對高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平及腎臟病理改變的影響，并從尿酸生成途徑與排泄途徑探究了鵝肌肽對高尿酸血癥可能的影響機制。目前高尿酸模型造模方法眾多，但單藥物造模往往劑量各異，對高尿酸血癥的觀察周期較短，難以評判其長久穩(wěn)定性[15]。而氧嗪酸鉀作為尿酸酶抑制劑在高尿酸血癥嚙齒類動物聯(lián)合造模中具有血清尿酸水平迅速升高、維持時間長、腎臟損傷程度較輕的優(yōu)點[16]，故本研究采用了聯(lián)合造模的方法以提高模型的成功率和穩(wěn)定性。利用酵母膏（增加體內(nèi)尿酸前體物質(zhì)）和氧嗪酸鉀（尿酸酶抑制劑）聯(lián)合，在一定程度上能減少對腎功能的損傷[17-18]。實驗進行6周后，高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平明顯升高，與空白組有顯著性差異。觀察腎臟組織學(xué)切片，高尿酸血癥組大鼠腎小管管腔擴張，上皮細胞空泡變性，腎臟損傷整體符合高尿酸血癥大鼠腎臟病理損傷機制。

在本研究中，鵝肌肽各干預(yù)組血清尿酸水平較高尿酸血癥組有顯著下降，且與陽性對照組別嘌呤醇組相比，鵝肌肽10 mg組下降最為顯著，提示鵝肌肽對高尿酸血癥的干預(yù)效果可能與干預(yù)劑量有關(guān)，這與之前鵝肌肽和血清尿酸相關(guān)研究的結(jié)果一致[19-20]。然而，和之前研究不同的是，鵝肌肽各干預(yù)組的血清尿素氮及肌酐的下降并不明顯，同時，鵝肌肽對高尿酸血癥大鼠體內(nèi)的黃嘌呤氧化酶活性未見顯著影響。Noguchi等[21]分別用肌酐和鵝肌肽喂養(yǎng)Wistar大鼠1 w后，鵝肌肽組大鼠血清尿酸水平低于肌苷組（對照組）。芯片分析顯示，與肌苷組相比，鵝肌肽組大鼠肝臟中次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶的表達明顯增加。次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶通過補救合成途徑使次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸和鳥嘌呤轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤核苷酸增加，最終導(dǎo)致尿酸的生成減少。初步推斷，鵝肌肽并非通過抑制黃嘌呤氧化酶活性減少尿酸生成來降低血清尿酸水平。

經(jīng)鵝肌肽干預(yù)后，大鼠尿量、尿酸及肌酐的清除率較高尿酸血癥組顯著增加，鵝肌肽100 mg組的胱抑素C水平與高尿酸血癥組有統(tǒng)計學(xué)差異，這與之前的相關(guān)研究結(jié)果機制類似[22]。鵝肌肽具有良好的pH緩沖性能，可能通過影響體液的pH值，從而提高尿酸的溶解度，促進尿酸的排泄[23]。鵝肌肽等二肽還具有強大的抗氧化性能，不僅可以通過直接清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物，還能通過調(diào)節(jié)線粒體功能來減少氧化應(yīng)激水平[24-26]。Masut[20]實驗中就表明了，鵝肌肽可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)子緩沖容量調(diào)節(jié)尿液pH值來增加尿酸溶解和促進尿液排泄，最終降低尿酸水平。同時，腎臟組織學(xué)分析顯示，與高尿酸血癥組相比，鵝肌肽各干預(yù)組比別嘌呤醇組更能明顯改善管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡變性，延緩高尿酸血癥大鼠的腎臟損傷。因此，結(jié)合本次實驗的數(shù)據(jù)分析結(jié)果和目前現(xiàn)有的研究，鵝肌肽可能是通過補救合成途徑來抑制尿酸生成，減少尿酸的重吸收以及增加尿酸的排泄，來達到降低尿酸水平，防治高尿酸血癥的效果。

然而，目前關(guān)于鵝肌肽降尿酸作用的研究還不多見，在未來還需要進行更多的機制以及人群實驗，以便更深入的明確鵝肌肽對高尿酸血癥的作用效果。◇

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Effect of Anserine on Hyperuricemia Rats

ZHANG Ya-qin，ZHANG Zhao-feng，ZHANG Wei，SUMIYA·Aihemaitijiang，YE Chen，MAIREPAITI·Halimulati

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University/Beijings Key Laboratory of Food Safety Toxicology Research and Evaluation，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To study the mechanism of anserine on hyperuricemia rats.Method Totally 60 male SD rats were selected and randomly divided into 6 groups including：CON，HUA，Allo，Ans 1 mg，Ans 10 mg，Ans 100 mg.The blank control group was fed with diet of normal rats，all the others were fed hyperuricemia fodder，and the corresponding substances were given by gavage.After 6 weeks of the experiment，the urine volume of the rats was collected for 24 h.At the end of the experiment，the rats were sacrificed to evaluate the biochemical indexes of renal function and observe the kidney histology.Result At the end of the 6th week of the experiment，compared with CON group，the uric acid level of HUA group was significantly increased（P<0.05），and there were significant differences in blood urea nitrogen，urine volume and uric acid excretion indexes（P<0.05）.Compared with the HUA group，serum uric acid levels of Ans 10 mg and Ans 100 mg in anserine intervention group were decreased（P<0.05），urine volume and uric acid excretion indexes had significant differences（P<0.05），Ans 1 mg of cystatin C and Ans 100 mg of serum ADA were significantly reduced（P<0.05）.Histological analysis showed that the dilatation of lumen and vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells in the intervention groups were significantly improved，with no fibrosis and little difference from the blank control group，which could significantly delay the renal injury of hyperuricemia rats.Conclusion Anserine can reduce serum uric acid level and protect renal function by increasing urine volume and excretion of renal uric acid in rats.

Keywords：hyperuricemia;anserine;uric acid;discharge rate