人參皂苷Rb1對兔離體腸平滑肌收縮活動的影響*

楊麒民，羅 濤，李春臣，劉 鑫，陳 衛，陳 緣，郭 芮，張建武

川北醫學院，四川 南充637100

人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷，主要分布于五加科植物人參、三七、西洋參等植物中，具有多種藥理活性，是一種具有較高藥用價值的化學物質。人參、三七、西洋參都是傳統中藥，應用歷史悠久，人參主補五臟，能增強機體免疫力，抗休克、抗腫瘤，對肝臟疾病也有一定的治療作用［1-3］。隨著對人參主要活性成分Rb1的深入研究，醫學界對其在中樞神經系統、心血管系統、免疫系統及抗腫瘤、抗肝臟熱缺血再灌注等方面的研究非常廣泛［4］。裴娟慧等［5］發現，人參皂苷Rb1對大鼠心室肌細胞L-型鈣電流有明顯的抑制作用，而抑制L-型Ca2+通道是抗心律失常的重要機制，即對心肌收縮舒張具有影響。由于心肌與腸道平滑肌結構和功能上存在部分區別，且其對腸道平滑肌收縮活動的影響尚無報道，故此筆者進行了人參皂苷Rb1對正常狀態下家兔離體腸平滑肌自發性收縮活動影響的研究，為進一步開發利用人參皂苷Rb1藥用價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物中國白兔，體質健康，雌雄兼半，體質量（2.3±0.5）kg，由川北醫學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（川）2018-076。飼養條件：家兔飼養于23～26℃、濕度適宜的實驗室環境，12 h光照黑暗循環，實驗前動物自由飲水，但需禁食24 h。

1.2 試藥及試劑人參皂苷Rb1（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-17060106）；釕紅（ruthenium red，RR，源葉生物科技有限公司，批號：11103-72-3）；肝素（heparin，HP，成都市科華化工試劑廠，批號：9041-08-1）；鹽酸維拉帕米注射液（Verapamil，V，上海禾豐制藥有限公司，批號：43161001，規格：2 mL∶5 mL/支）；新鮮的臺氏液（g/L）：川北醫學院機能實驗中心制劑（NaCl 40 g，10% KCl 1 g，CaCl21 g，NaHCO35 g，10%MgSO4·7H2O1.3 g，5%NaH2PO4·2H2O 0.325 g，C6H12O65.5 g RO水5000 mL）。

1.3 實驗儀器兔類通用實驗器械；BL-420型生物機能實驗系統（四川成都泰盟公司）；FT-100型生物張力傳感器（四川成都泰盟軟件有限公司）；HW-400E型恒溫平滑肌槽（四川成都泰盟科技有限公司）；優普純水/超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 人參皂苷Rb1溶液制備 預熱電子天平30 min后，準確稱量人參皂苷Rb1，加入臺氏液，定容至10～2 mol/L即成。

1.4.2 兔離體腸平滑肌標本的制備［6］取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹中線打開腹腔，以胃幽門與十二指腸交界處為起點剪取腸管，每只兔取十二指腸同一腸段置于盛有室溫飽和臺氏液的燒杯中，洗凈腸內容物，剪成1.5～2.0 cm的腸段作為實驗標本。

1.4.3 腸管舒縮活動的記錄 打開BL-420F生物機能實驗系統，調零，定標，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調節恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺式液加入預管內，藥物管加入16 mL臺式液。將標本一端固定于L-型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續通入混合氣體（96%O2，4%CO2），每秒1～2個氣泡，溫度在37℃，標準負荷1 g，平衡1 h，待腸管穩定后，開始進行實驗。

1.4.4 人參皂苷Rb1對兔離體腸平滑肌收縮的影響 待腸管收縮穩定后，用BL-420生物機能實驗系統描記一段腸管正常收縮曲線，累積加入已配好的人參皂苷Rb1，使終濃度分別達到50、70、90 μmol/L，加藥間隔時間為5 min，同時設置一組空白組，于空白組中加入等量臺氏液進行實驗。觀察腸道運動曲線，用區間測量法記錄加藥前1 min和加藥后第5 min的腸道收縮數據（峰峰值、平均值、頻率）。

1.4.5 HP、RR和維拉帕米預處理腸管后對人參皂苷Rb1作用于腸管收縮活動的影響 待腸管收縮曲線穩定后，隨機分成對照組、釕紅組、肝素組、維拉帕米組。分別加入肌漿網ryanodine受體阻斷劑釕紅（ruthenium red，RR）10 μmol/L，IP3受體阻斷劑肝素（heparin，HP）50 mg/L，L-型Ca2+通道拮抗劑維拉帕米（verapamil）0.1 μmol/L孵育15 min，同時設置一組對照組，用等量臺式液孵育15 min，當各組孵育后的平滑肌收縮達到平臺期后再累計加入人參皂苷Rb1，使終濃度分別達到50、70、90 μmol/L，加藥間隔為5 min，記錄加入人參皂苷Rb1后第5 min腸管收縮的平均收縮力的變化。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件處理實驗數據，計量資料采用±s表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔離體小腸平滑肌的收縮活動在空白組中加入溶劑臺式液，對兔離體腸平滑肌的自發性收縮活動并無明顯的影響（P＞0.05）。人參皂苷Rb1在50～90 μmol/L濃度梯度內能劑量依賴性的抑制兔離體小腸平滑肌的收縮（P＜0.05）。見圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對兔小腸平滑肌收縮的影響

2.2 兔離體小腸平滑肌運動的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅與給藥前比較，人參皂苷Rb1對腸管收縮的頻率無影響（P＞0.05）；較低濃度的人參皂苷Rb1（50 μmol/L）對腸管的收縮張力具有抑制作用，隨濃度增加，腸管的收縮張力明顯受到抑制（P＜0.01）；較低濃度的人參皂苷Rb1（50 μmol/L）對腸管的收縮幅度具有抑制作用，隨濃度的增加，腸管的收縮幅度明顯受到抑制（P＜0.01）。見表1。

表1 不同劑量人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅的影響（±s）

表1 不同劑量人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅的影響（±s）

注：與給藥前（人參皂苷Rb10 μmol/L）比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

?

2.3 HP、RR和維拉帕米預處理腸管后對人參皂苷Rb1作用于離體腸管活動的影響與對照組比較，在釕紅組中，用ryanodine受體阻斷劑RR預孵后，離體小腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，在低濃度時離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強（P＜0.05），隨著人參皂苷Rb1的濃度增加，離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強更為明顯（P＜0.01），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與抑制ryanodine受體有關。2）與對照組比較，在肝素組中，用IP3受體阻斷劑HP預孵后，離體腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，濃度達到70 μmol/L時，離體小腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強（P＜0.05），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與抑制IP3受體有關。3）與對照組比較，在維拉帕米組中，用L-型Ca2+通道拮抗劑維拉帕米預孵后，離體腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度明顯增強（P＜0.01），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與阻斷L-型Ca2+通道有關。見表2。

表2 釕紅、肝素、維拉帕米預處理后人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌活動的影響（±s）

表2 釕紅、肝素、維拉帕米預處理后人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌活動的影響（±s）

注：與給藥前（人參皂苷Rb10 μmol/L）比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

?

3 討論

腹痛、腹瀉等胃腸道疾病通常是由胃腸平滑肌痙攣引起的。腸平滑肌細胞內Ca2+是腸平滑肌收縮的偶聯因子，與腸平滑肌興奮-收縮偶聯存在著緊密的關系，細胞外Ca2+進入細胞平滑肌細胞內和細胞內Ca2+肌質網內Ca2+釋放是細胞內Ca2+升高的主要途徑［7］，當胞內Ca2+濃度達到一定水平時，與肌鈣蛋白或肌調蛋白結合，觸發平滑肌收縮［8］。通過實驗結果發現，人參皂苷Rb1能夠濃度依賴性的抑制腸平滑肌的自發性收縮，針對人參皂苷Rb1所具有的腸平滑肌的舒張作用，對其與外Ca2+進入的通道和內Ca2+釋放的相關受體的影響進行了初步的探究。

細胞內Ca2+的釋放主要來自于肌漿網，而肌漿網內釋放的Ca2+主要通過IP3和ryanodine受體來完成。當這些受體被激活后，可引起肌漿網內鈣離子的釋放，從而導致細胞內鈣離子濃度增加，誘導平滑肌收縮［9-11］。本實驗通過用ryanodine受體阻斷劑RR和IP3受體阻斷劑HP對腸管進行預處理，來探究人參皂苷Rb1對細胞內Ca2+的釋放的相關受體的影響。ryanodine受體是存在于肌細胞肌質網和其他細胞內質網的胞內鈣釋放通道之一，Ca2+集合后激活RyR1使通道在開放和關閉狀態隨機轉換；進一步集合咖啡因則可將通道保持在開放狀態。ryanodine結合于孔道側壁，低濃度時可將通道鎖定在亞電導狀態（有部分離子流通過），高濃度則阻斷離子的通過［12］。實驗結果表明，使用RR預處理腸管后，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1通過抑制ryanodine受體途徑，使得細胞內Ca2+釋放減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。HP可作用于三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptor，IP3R），IP3R是廣泛存在于各種細胞內質網的一種鈣釋放通道家族，當IP3R與1，4，5三磷酸肌醇和鈣離子兩種底物分子結合后，IP3R開放，Ca2+便從內質網鈣庫釋放到細胞質中［13］。實驗結果表明，使用HP預處理腸管，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1通過抑制IP3受體途徑，引起細胞內Ca2+釋放減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。

細胞外的Ca2+主要是通過細胞膜上的Ca2+通道進入細胞內，腸平滑肌中主要的鈣通道是L型電壓依賴性Ca2+通道［14］。維拉帕米是L-型Ca2+通道拮抗劑，作用機制是阻滯外源性Ca2+經L-型鈣離子通道進入細胞內，降低胞內的Ca2+濃度，而Ca2+是細胞內重要的第二信使，高濃度的Ca2+可引起平滑肌收縮，低濃度Ca2+可引起平滑肌舒張［15］。本實驗通過用維拉帕米對腸管進行預處理，來探究人參皂苷Rb1對細胞外Ca2+的進入的相關通道的影響。實驗結果表明，使用維拉帕米處理腸管后，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1阻斷L-型Ca2+通道，使進入細胞內Ca2+減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。

綜上所述，人參皂苷Rb1可顯著抑制兔離體腸平滑肌自發性收縮，其機制可能是阻斷L-型Ca2+通道抑制外鈣內流，或阻斷ryanodine受體和IP3受體抑制內鈣釋放，最終使細胞內鈣離子濃度降低，從而抑制腸平滑肌的收縮。本實驗為人參皂苷Rb1應用于胃腸功能紊亂性疾病的治療提供了實驗依據。