金釵石斛多糖對非酒精性脂肪肝病大鼠TLR4和HO-1表達的影響*

喻 涓，范 艷，楊榆青，何 丹，宋 波，姚 政△

1云南師范大學醫院，云南 昆明650500；2云南中醫藥大學基礎醫學院；3昆明醫科大學基礎醫學院

隨著人們飲食結構的變化，非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病率逐年升高［1］。NAFLD疾病譜較廣，包括單純性NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic fatty hepatitis，NASH）、非酒精性肝纖維化、肝硬化等，主要病理特征為肝臟脂肪蓄積和肝細胞實質脂肪變性［2］。有研究顯示，NAFLD已經成為世界各國最常見的慢性肝病，甚至也成為肝纖維化和肝硬化的主要病因［3］。對于本病，臨床中并沒有特效藥，因此開發新的藥物對于本病意義重大。金釵石斛是我國經典名貴中藥材之一［3］，相關研究［4-5］表明，金釵石斛多糖是金釵石斛主要的有效藥理成分之一，其在抗腫瘤、促進免疫反應、抗氧化以及消炎方面均具有很好的效果。目前金釵石斛多糖對NAFLD的作用尚無文獻報道，為此本研究采用高脂高糖飲食構建NAFLD大鼠模型，觀察其對肝功能、炎性因子的影響，并從TLR4和HO-1蛋白分析和探討其可能的作用機制，為金釵石斛多糖的開發和NAFLD的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性清潔級SD大鼠72只，體質量160～180 g，購于昆明醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK-（云）2011-004，大鼠購買后飼養于云南中醫藥大學動物實驗房，由專業人員統一飼養，實驗室溫度、濕度及光照時間按照標準統一設定。

1.2 實驗儀器PT-3502型酶標儀（北京普天新橋技術有限公司）；752N型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；XSP-9CA型光學顯微鏡（上海光學儀器廠）；EMUC7型石蠟切片機（德國徠卡）；PPDT-12C1型梯度脫水機（湖北徠克醫療儀器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳儀（美國伯樂）；StepOne TM型實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。

1.3 藥物及試劑普通飼料、高脂飼料［昆明醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：蘇飼證（2018）10030］；金釵石斛多糖（濃度98%，上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：180615）；多烯磷脂酰膽堿膠囊［賽諾菲（北京）制藥有限公司，批號：180726］；多聚甲醛（淄博齊星化學科技有限公司，批號：180707）；天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）（南京建成生物工程研究所，批號：180822）；血清白細胞介素6（interleukin-6，IL-6，批號：180911）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（武漢博士德生物工程有限公司，批號：180706）；BCA蛋白定量試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，批號：181009）；Toll樣受體4（Toll-like receptors-4，TLR4）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）［賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號：181115、181205］；引物（上海生物生工）。

1.4 分組及造模1）所有大鼠購買后按照隨機數字法分為正常組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，金釵石斛多糖高、中、低劑量組，每組12只，分組后適應性喂養1周后給予相應飼料造模。除正常組外，其余各組給予高脂飼料喂養制備NAFLD大鼠模型，8周后每組各取2只檢驗造模是否成功，造模成功標準為大鼠肝臟切片HE染色有明顯脂肪顆粒浸潤，同時血清肝功能AST和ALT明顯升高。2）正常組和模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予23 mg/（kg·d）多烯磷脂酰膽堿灌胃，灌胃時將其溶于2 mL的生理鹽水中，金釵石斛多糖低、中和高劑量組分別給予金釵石斛多糖50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，灌胃時將其溶于2 mL的生理鹽水中，灌胃4周后處死大鼠，進行后續試驗。

1.5 觀察指標大鼠于處死前夜禁食不禁水12 h，然后采用3%的戊巴比妥溶液8 mL腹腔注射麻醉，麻醉后將其固定于解剖版，采用腹主動脈取血法收集血液，血液收集后于4℃、離心半徑6 cm，4000 r/min離心10 min，收集血清，將其置入超低溫冰箱中用于相關生化指標的檢測，完成后取出肝臟，切取肝臟組織約2 mm3，置入4%的多聚甲醛溶液中用于組織病理學檢測，其余組織置入超低溫冰箱中，用于TLR4和HO-1蛋白和mRNA的檢測。

1.5.1 一般情況 于每次喂食和喂水前觀察并記錄大鼠活動狀況，同時統計飲食量，觀察毛色和精神狀態。

1.5.2 肝功能及炎性因子指標 血清ALT和AST的測定嚴格按照試劑盒提供的說明書進行，采用分光光度計測定。血清IL-6和TNF-α的測定嚴格按照試劑盒提供的說明書進行，采用酶標儀測定。

1.5.3 組織病理學觀察 肝臟組織病理學檢測采用HE染色法，從浸泡24 h的多聚甲醛溶液中取出肝臟組織，自來水反復沖洗24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，完成后石蠟包埋，切片機切成3～5 μm厚薄片，脫蠟后依次經蘇木精和伊紅染色，最后中性樹膠封片即完成。

1.5.4 采用Western blot測定大鼠蛋白表達 稱取1 g肝臟組織，用組織裂解液充分裂解后取上清，BCA法測定蛋白濃度后調平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后，半干轉移法轉移到PVDF膜，脫脂牛奶封閉后洗滌，加入一抗［TLR4（1∶2000），HO-1（1∶1000），β-actin（1：5000）］孵育后洗滌，加入二抗（1∶5000）孵育并洗滌，暗室曝光進行洗片和定影，結果以目的蛋白與β-actin積分光密度值比值表示，每組實驗重復3次。

1.5.5 采用QT-PCR檢測肝組織TLR4和HO-1 mRNA表達 采用總RNA試劑盒提取總RNA后，將其逆轉錄為cDNA后，每組取2 μg行實時熒光定量PCR擴增反應，擴增條件為95℃2 min、94℃10 s、60℃10 s、72℃40 s，循環次數36次。分析方法選用2-ΔΔCt法，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，經檢驗所有數據均符合正態分布，多組間比較采用F檢驗，組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況各組大鼠均未死亡，此外正常組精神飽滿，活潑好動，毛色光滑，大小便正常；模型組大鼠出現明顯精神萎靡、活動量降低、毛色發黃灰暗及尿液發臭，相較于模型組，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各組精神狀態有一定好轉，活動量增加，毛色較光澤。

2.2 肝功能及炎癥因子水平與正常組比較，模型組大鼠AST、ALT、IL-6、TNF-α水平均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組上述指標均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；金釵石斛多糖各劑量組AST、ALT水平與多烯磷脂酰膽堿組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；金釵石斛多糖中、高劑量組IL-6和TNF-α水平明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝功能指標及炎癥因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠肝功能指標及炎癥因子水平比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與多烯磷脂酰膽堿組比較，P＜0.05

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2.3 大鼠肝臟HE染色觀察正常組大鼠肝臟組織細胞核大小均一，形態正常，無纖維和組織增生；模型組大鼠則出現明顯被脂肪空泡，肝小葉明顯破壞，同時細胞排列紊亂，有一定程度炎癥浸潤，與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組脂肪浸潤程度明顯降低，炎性浸潤降低，肝臟整體外觀明顯改善。其中金釵石斛多糖各劑量組肝組織病理改善最為明顯，脂肪顆粒顯著減少，且肝小葉清晰，改善程度呈現明顯劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織切片（HE×400）

2.4 TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達與正常組比較，模型組肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；金釵石斛多糖中、高劑量組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝臟組織TLR4和HO-1蛋白表達

表3 各組大鼠肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相對表達量比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與多烯磷脂酰膽堿組比較，P＜0.05

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3 討論

目前文獻［6-11］中報道較多單純高脂和膽堿-蛋氨酸缺乏飲食誘導的NAFLD模型。單純高脂高糖飲食可以模擬出胰島素抵抗型動物模型，膽堿-蛋氨酸缺乏飲食則可以誘導脂肪肝同時并發膽囊損壞模型。本研究根據藥物特點，選用了高脂高糖飲食誘導型，本模型目前在造模方法上已經完全成熟，此外價格相對便宜。由于金釵石斛多糖具有一定的降血糖效果［12］，以此動物模型來驗證藥物效果具有針對性。

近年來，關于金釵石斛多糖藥理學研究受到越來越多學者的關注，如國內賓捷等［13］研究發現金釵石斛在提高衰老小鼠機體的抗氧化能力方面具有很好的效果，可抑制血清中NDA的升高，同時增加抗氧化因子SOD和GSH的活性。此外關于金釵石斛多糖的抗癌、消炎作用有文獻報道［14-15］，國內學者［16］采用金釵石斛多糖治療高脂血癥的Wistar大鼠研究結果表明，金釵石斛多糖可明顯降低血清總膽固醇和甘油三酯水平。

ALT和AST是重要的肝功能評價指標，其中ALT主要存在于肝臟、心肌和骨骼肌。ALT能夠準確反映肝細胞的損傷程度，此外ALT的升高多見于肝臟的急性損傷。AST則主要在心肌、肝及腎組織線粒體中，AST主要對應的為肝細胞的慢性損傷［17-18］。本實驗研究結果發現，給予NAFLD大鼠金釵石斛多糖治療，大鼠肝功能指標AST和ALT相較于模型組明顯降低，這證實金釵石斛多糖對NAFLD大鼠肝功能具有調節作用。在NAFLD大鼠肝功能損傷過程中TLR信號通路和HO-1信號通路參與了其炎癥反應的進程［19］，其中TLR屬于模式識別受體，在進化中具有高速保守性，目前研究發現TLR家族主要有12個重要成員，研究最多的為TLR4，TLR4信號通路主要介導肝損傷過程中IL-6、TNF-α的應答。在炎癥反應的過程中HO家族蛋白和TLR家族蛋白相互作用，共同促進疾病的發生和進展，HO家族相關蛋白是身體內重要的應激反應蛋白的一種，其也是一種起始酶和限速酶，可有效的催化血紅素降解過程，在NAFLD發生后，機體處于低氧狀態，同時有部分內毒素刺激，可造成HO-1分泌的增加，HO-1分泌的增加可降低組織炎癥反應，進而對肝細胞起到保護作用。本次研究結果顯示，與正常組相比，模型組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達明顯升高，同時TLR4調控的下游炎性因子IL-6和TNF-α也明顯升高，這提示在NAFLD發生和發展過程中，炎癥反應可隨著NAFLD的發生而升高，采用金釵石斛多糖治療后，大鼠肝臟中正常組大鼠TLR4和HO-1蛋白及mRNA、IL-6和TNF-α均明顯降低，這提示金釵石斛多糖對NAFLD大鼠炎癥反應具有改善作用。

綜上所述，金釵石斛多糖可明顯改善受損的NAFLD肝臟，改善肝功能，這與金釵石斛多糖可下調HO-1和TLR4表達，進而降低炎癥反應刺激有關。