基于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)探究二十味沉香丸對(duì)卒中后PTSD模型大鼠的調(diào)節(jié)作用*

李姝蒙，劉忠瀚，殷曉輝，俞 邦，朱泠霏，武慧超，毛 萌△

1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院

腦卒中（cerebral stroke，CS）是由腦血管破裂或阻塞，導(dǎo)致局部神經(jīng)組織損傷而引發(fā)神經(jīng)功能障礙的一類(lèi)疾病。該病通常包括腦出血、腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血等在內(nèi)，具有高死亡率、高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率及高致殘率等特點(diǎn)［1］。創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post traumatic stress disorder，PTSD）是經(jīng)歷異乎尋常的災(zāi)難性心理創(chuàng)傷事件（如嚴(yán)重車(chē)禍、戰(zhàn)爭(zhēng)、地震等），繼發(fā)出現(xiàn)的一種普遍性與復(fù)雜性的精神類(lèi)疾病［2］。其主要癥狀包括創(chuàng)傷事件的再體驗(yàn)、回避反應(yīng)及高警覺(jué)狀態(tài)等［3］。腦卒中本身對(duì)患者生活及心理造成巨大影響，并具有不可預(yù)見(jiàn)的特點(diǎn)，足以成為引起PTSD的內(nèi)在應(yīng)激原，引發(fā)患者出現(xiàn)與尋常PTSD十分類(lèi)似的臨床表現(xiàn)。前期研究顯示，腦中動(dòng)脈線栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模后動(dòng)物出現(xiàn)了一定的PTSD狀態(tài)［4］。所以項(xiàng)目組在MCAO造模后篩選符合要求的模型動(dòng)物為最終入組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從而復(fù)制卒中后PTSD模型。

藏藥中“二十味沉香丸”是由阿旺白桑［5］在“八味沉香丸”的基礎(chǔ)上，添加紅花、珍珠母、牛黃、降香等二十味藥而成，收載于其所著的《驗(yàn)方集萃》中。該方具有調(diào)和氣血、安神鎮(zhèn)靜、化瘀止痛的功效。研究表明，其對(duì)卒中后肢體運(yùn)動(dòng)及精神障礙有良好的治療效果，可調(diào)理精神、意識(shí)、思維等。二十味沉香丸以治療卒中為本，“調(diào)隆”以調(diào)情志，其特殊的炮炙方法還可降低毒性，提高藥效。張濤等［6］研究發(fā)現(xiàn)帕羅西汀聯(lián)合二十味沉香丸可快速改焦慮癥患者癥狀，提高治愈率。由此可見(jiàn)，二十味沉香丸治療卒中后PTSD具有一定優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，筆者就二十味沉香丸對(duì)卒中后PTSD的作用效果進(jìn)行了研究，將從新的領(lǐng)域和途徑，為卒中患者常見(jiàn)的精神共病提供治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（北京），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0030，并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品二十味沉香丸（西藏甘露藏藥股份有限公司，批號(hào)：17063A，規(guī)格：56 mg/丸）。組成及比例依據(jù)藏醫(yī)學(xué)家阿旺白桑所著的《驗(yàn)方集萃》［5］，藥物組成：沉香、廣棗、天竺黃、牛黃、兔心紅花、馬錢(qián)子、乳香、石決明、紫檀香、肉豆蔻、鹿茸、木香、丁香、訶子、余甘子等20味藥。用生理鹽水配成0.072 g/mL的懸濁液。灌胃按照按照每1 mL/100 g體質(zhì)量給藥。帕羅西汀（浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1354E18031，規(guī)格：20 mg/片），使用生理水配置成0.045 g/mL的懸濁液。藥物配成后分裝并密封，置于4℃冰箱中備用。灌胃按照每1 mL/100 g給藥。

1.3 儀器設(shè)備木質(zhì)曠場(chǎng)箱由北京中醫(yī)藥大學(xué)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。行為學(xué)分析系統(tǒng)（Nodule公司）包括計(jì)算機(jī)、攝像頭以及行為學(xué)分析軟件。

1.4 模型制備采用MCAO［4］建立局灶性腦缺血模型大鼠模型。1）栓線制備：用長(zhǎng)約40 mm，直徑為0.23 mm的魚(yú)線，砂紙細(xì)磨頭端使之變鈍，頭端涂清漆，處理后頭端變圓鈍，直徑約0.26～0.28 mm，在距此頭端10、18、20 mm處分別作標(biāo)記。酒精擦洗后37℃烤箱烤干，無(wú)菌保存?zhèn)溆谩?）模型制備：Wistar大鼠禁食12 h后，天秤稱(chēng)取動(dòng)物體質(zhì)量，稀釋為10%的水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉動(dòng)物。麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒備皮。經(jīng)頸部正中切開(kāi)皮膚，切口約2.5 cm，鈍性分離肌肉及皮下組織，暴露頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA），注意不要損傷迷走神經(jīng)，切忌鉗夾。然后沿CCA向上分離頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和 頸 內(nèi) 動(dòng) 脈（internal carotid artery，ICA），結(jié)扎CCA、ECA，于CCA近分叉處剪一小口，經(jīng)切口插入制備好的栓線（預(yù)先蘸少許肝素鈉溶液抗凝），微遇阻力時(shí)停止，進(jìn)線深度約為18～20 mm。如栓線進(jìn)入血管約10 mm后再進(jìn)困難，調(diào)整栓線角度后仍不能進(jìn)入，則游離出ICA顱外唯一分支大腦腳穿動(dòng)脈（perforator artery of cerebral peduncle，PPA），并在PPA的起始部置一血管夾，以防止栓線進(jìn)入PPA。栓線經(jīng)過(guò)CCA分叉處、ICA進(jìn)入顱底至較細(xì)的大腦前動(dòng)脈（anterior cerebral artery，ACA），以阻斷來(lái)源于同側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈及大腦后動(dòng)脈的血流供應(yīng)，即完成對(duì)右側(cè)大腦中動(dòng)脈（middle cerebral arteries，MCA）的阻塞［6］。撤掉PPA處的血管夾，固定栓子后逐層縫合皮膚。清除術(shù)野，關(guān)閉切口。術(shù)后動(dòng)物分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水，室溫控制在25℃左右。假手術(shù)組只分離血管，不阻斷血流。腦中動(dòng)脈線栓法造模后參照LONGA等［7］的大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法，篩選符合要求的模型動(dòng)物。

1.5 分組及給藥1）將大鼠進(jìn)行卒中后PTSD造模，隨機(jī)分為5組，正常組、假手術(shù)組每組各6只，模型組、二十味沉香丸組、帕羅西汀組每組各10只。造模后篩選符合要求的模型動(dòng)物為最終入組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，重新進(jìn)行隨機(jī)分組，最終正常組、假手術(shù)組、模型組、二十味沉香丸組及帕羅西汀組每組各6只。2）經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將各組動(dòng)物每晚19∶00進(jìn)行灌胃，灌胃前將二十味沉香丸懸濁液及帕羅西汀懸濁液搖勻。正常組、假手術(shù)組、模型組給予1 mL/100 g生理鹽水灌胃，二十味沉香丸組給予1 mL/100 g二十味沉香丸懸濁液灌胃，帕羅西汀組給予1 mL/100 g帕羅西汀懸濁液灌胃，連續(xù)灌胃2周。

1.6 觀察指標(biāo)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)采用立方形灰色木質(zhì)曠場(chǎng)箱，長(zhǎng)100 cm，高100 cm，高45 cm，曠場(chǎng)箱底部用黑線劃分出25個(gè)正方形格（20 cm×20 cm），攝像頭置于曠場(chǎng)箱正上方。實(shí)驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中央格，開(kāi)始進(jìn)行5 min錄像，錄像過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員著黑衣，且避免來(lái)回走動(dòng)。觀察記錄大鼠直立次數(shù)、直立時(shí)間、修飾次數(shù)及修飾時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用酒精清洗方箱內(nèi)部，以免上一只大鼠留下的氣味影響下次測(cè)試。錄像結(jié)束后采用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)錄像進(jìn)行分析，測(cè)得每組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間等指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s描述，若資料類(lèi)型為正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較；若為偏態(tài)分布的資料，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)，模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、直立次數(shù)、直立時(shí)間、修飾次數(shù)及修飾時(shí)間，模型組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、直立次數(shù)及直立時(shí)間，二十味沉香丸組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)及直立次數(shù)，帕羅西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1—2。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，b表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，d表示P＜0.01；與模型組比較，e表示P＜0.05

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2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡相較于正常組及假手術(shù)組，模型組自主運(yùn)動(dòng)活性顯著降低，活動(dòng)僅局限在箱內(nèi)底面中央格到角落；相較于模型組，二十味沉香丸組自主運(yùn)動(dòng)顯著增加，活動(dòng)集中在邊角部位且與帕羅西汀組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)垂直指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)垂直指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，a表示P＜0.05；與假手術(shù)組比較，c表示P＜0.05；與模型組比較，e表示P＜0.05，f表示P＜0.01

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圖1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡

3 討論

腦卒中作為全球第二大、中國(guó)第一大致死性疾病，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量。臨床中，腦卒中患者大多伴有不同程度的精神障礙［8-9］，而卒中后PTSD并未受到足夠的重視。有數(shù)據(jù)顯示［10］，在無(wú)明顯意識(shí)狀態(tài)下的腦卒中患者腦卒中3～4周內(nèi)PTSD的發(fā)生率為80.9%。有文獻(xiàn)顯示［11］，女性患者的發(fā)病率更高。相較其他卒中后的精神障礙，PTSD與卒中發(fā)生的次數(shù)、消極事件等關(guān)系更為密切，且有不易隨時(shí)間而減輕的特點(diǎn)［12-13］。卒中后PTSD發(fā)病后遷延難愈，對(duì)患者及家屬造成嚴(yán)重?fù)p傷，然而國(guó)內(nèi)對(duì)卒中后PTSD的治療研究較少，其病機(jī)與治療仍在進(jìn)一步的探索中。

目前，MCAO是公認(rèn)的較為理想的制備大腦中動(dòng)脈缺血的方法，能有效模擬缺血性腦卒中癥狀。且本團(tuán)隊(duì)前期研究［5］顯示，MCAO造模后造成了一定的PTSD狀態(tài)。所以項(xiàng)目組MCAO造模后篩選符合要求的模型動(dòng)物為最終入組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從而復(fù)制卒中后PTSD模型。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠在自然狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)情況，能較好地反映出動(dòng)物的焦慮水平。故本研究采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)造模成功與否及藥物作用效果的指標(biāo)。既往研究表明，五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑帕羅西汀對(duì)PTSD有較好的治療效果，且對(duì)卒中后精神障礙類(lèi)疾病也具有一定的治療作用，因而本研究采用帕羅西汀作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)較正常組減少；模型組大鼠穿格次數(shù)、運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)、直立時(shí)間、修飾次數(shù)及修飾時(shí)間較假手術(shù)組減少，提示模型組大鼠焦慮樣行為增加，提示模型成功復(fù)制。二十味沉香丸組運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、直立時(shí)間及直立次數(shù)較模型組增加，提示使用二十味沉香丸在一定程度上能有效改善卒中后PTSD模型大鼠的焦慮樣行為；帕羅西汀組大鼠穿格次數(shù)、運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)較模型組增加，提示帕羅西汀對(duì)卒中后PTSD有一定的治療作用。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，二十味沉香丸對(duì)卒中后PTSD大鼠的行為學(xué)異常具有一定的改善作用，將二十味沉香丸運(yùn)用于卒中后PTSD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究其治療機(jī)制，將從新的領(lǐng)域和途徑，為卒中患者常見(jiàn)的精神共病提供治療思路，也將為卒中后PTSD的臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。