兒童肺炎支原體感染的兩種檢測方法比較

周仁希 林曉偉 陳東 周俊 吳亦棟 葉蓓

肺炎支原體（MP）是引起兒童呼吸道感染的常見病原微生物之一［1］，在兒童呼吸道感染中約占30%。臨床癥狀可從輕微的支氣管炎到重癥肺炎，嚴重感染可導致死亡，MP 也能引起多種呼吸道外并發癥，其中屬消化系統癥狀最常見。MP 感染在≥5 歲肺炎患兒中，其感染率可達50%［2］，在因呼吸道感染的住院患兒中約>19.1%［3］。由于支原體肺炎（MPP）早期臨床表現多樣、影像學檢查無顯著特征，因此，實驗室特異、快速檢測MP 對兒童MP 感染臨床診斷以及監測患兒預后具有重要的意義。本文通過酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測MP 抗體IgM 與實時熒光定量PCR 法（RT-PCR）檢測MP 核酸的對照分析，探討MP 感染的兩種不同實驗室檢測方法在臨床診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018 年1 月至12 月杭州市兒童醫院同時行肺炎支原體抗體IgM 檢測及肺炎支原體核酸檢測的6091 例住院患兒的臨床資料，年齡22 天～15歲。患兒入院后，同時采集血清樣本和咽拭子（或痰標本）各1 份及時做肺炎支原體抗體IgM 和核酸檢測。

1.2 方法（1）儀器與試劑：抗肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒購自歐盟醫學診斷有限公司，肺炎支原體核酸檢測試劑盒購自廣州中山大學達安基因股份有限公司，ABI 7500 型實時熒光定量PCR 基因擴增儀（美國ABI 公司），HydroFlex 洗板機和Sunrise 酶標儀（Tecan公司）。（2）ELISA 檢測：采用ELISA 原理，微孔板條上包被的肺炎支原體抗原可與稀釋樣本中的IgM 結合，加入酶標抗人IgM 抗體溫育后加底物顯色。具體檢測方法嚴格根據使用說明書進行，每板設陰性對照3 孔，陽性對照2 孔和空白對照1 孔。設定酶標儀波長于450nm處，用空白孔調零點后測定各孔吸光度（A 值），按照說明書上標定的范圍和標準判斷陽性和陰性。（3）RTPCR 檢測：取處理后樣品、陰性對照、陽性對照和空白對照的上清液2 μl 加入試劑盒反應液中做MP 核酸定量檢測。RT-PCR 反應循環條件：93℃ 2 min，1 個循環；93℃ 45 s，55℃ 60 s，10 個循環；93℃ 30 s，55℃45 s，30 個循環，操作嚴格按照試劑盒產品使用說明書。記錄陽性結果的Ct 值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件。計數資料用%表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MP檢測方法比較 MP抗體IgM陽性或MP核酸陽性共846 例，陽性率13.89%，其中562 例MP 抗體IgM檢測陽性（9.23%），383 例MP 核酸檢測陽性（6.29%），MP 抗體IgM 檢測陽性率高于MP 核酸，二者差異有統計學意義（χ2=134.82，P=0.00）（見表1）。兩種方法陽性不符合率為12.26%。

表1 MP抗體與核酸方法檢測結果比較

2.2 不同年齡與季節MP 陽性分布 兩種方法在不同年齡組均檢出MP 陽性，陽性結果主要集中在1～3 歲（51.42%），其次是4～6 歲（22.70%），差異有統計學意義（見表2）。不同季節均檢出MP 陽性，其中11-12 月份陽性率最高，其次是1 月份，其它季節散發（見圖1）。

表2 不同年齡組兩種不同檢測方法MP陽性的檢出情況

圖1 不同季節MP陽性分布情況（例數）

3 討論

MP 近年來發病率逐年增多，但由于其早期臨床表現多樣、病情輕重不一，反復，影像學檢查無顯著特征等，使得MP 鑒別診斷較為困難。此外MP 無細胞壁，導致作用于細胞壁的常見抗生素對MP 不敏感，因此對MP 感染較為特異、快速的實驗室檢測顯得十分重要。MPP 發病率在不同國家、不同地區差異較大［4］。本資料結果顯示，兩種方法結合檢測總陽性率為13.89%。MPP 好發于學齡期兒童，近年來<5 歲兒童MPP 的報道有所增加［5］，本資料結果顯示，MP 感染在1～6 歲兒童高發。MP 感染全年散發，不同地區的流行季節有所差異，北京MP 檢出陽性率在夏秋季及秋冬季較高［6］，南京以夏秋季高發［1］，而本資料結果顯示冬季高發。

人體感染MP 后能產生特異性IgM 類抗體，且通常在感染后第1 周出現，在第3 周達到最高滴度［7］，而MP 感染的潛伏期為2～3 周。兒童患者的特殊性導致其在臨床上較難采集雙份血清，本資料僅納入單份血清結果，其中284 例患兒核酸陽性而抗體IgM 陰性，不排除檢測時患兒處于感染早期甚至潛伏期而抗體IgM 未產生的可能。

PCR 法檢測MP 具有較高的敏感性和特異性，且不受患者年齡、病程進展、抗體產生的時間和患者免疫功能等因素的影響［8］，也可了解患者體內MP 感染及自我復制的情況，對早期檢測MP 感染具有重要意義。但PCR 法容易受操作技術影響，也不能區分無癥狀攜帶或急性感染。本資料中463 例抗體IgM 陽性而核酸陰性，不排除由于兒童無法配合導致取樣不準確造成假陰性的可能。而抗體IgM 陽性率較高，也可能存在部分抗肺炎衣原體抗體IgM、抗嗜肺軍團菌抗體IgM 等的交叉反應。本資料中，兩種方法陽性不符合率為12.26%。對于檢測結果不相符的患兒，核酸陽性可以作為MP 感染的預判，而抗體IgM 陽性的標本應該根據臨床癥狀體征、影像學檢查、用藥情況等作進一步判斷。

綜上所述，兩種方法在臨床診斷中相互彌補，建議同時選擇兩種方法以提高臨床檢出率。