腦卒中后抑郁大鼠海馬和丘腦神經(jīng)生長因子及其高親和力受體TrkA mRNA和蛋白的表達(dá)變化

劉新黎 馮炯 胡浩宇 陳家俊

腦卒中后抑郁（PSD）是腦卒中引起的一種有情感障礙性疾病［1］，是一種心理障礙，臨床癥狀顯著，主要為興趣減退、情緒低落，對患者預(yù)后造成嚴(yán)重不良影響［2-6］。同時(shí)，在腦卒中復(fù)發(fā)、神經(jīng)功能康復(fù)的影響因素中，PSD 也是一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究探討PSD大鼠海馬和丘腦神經(jīng)生長因子（NGF）及其高親和力受體TrkA mRNA 和蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 金華市職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的52 只清潔級健康成年雌性SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，符合實(shí)驗(yàn)處置動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。購自上海信裕生物科技有限公司生產(chǎn)的TrkA 兔抗單克隆抗體（xy11073-MM04）、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑NGF，上海科順生物科技有限公司生產(chǎn)的TR-IZOL 試劑盒、RTPCR 試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）引物、神經(jīng)生長因子（NGF）及其高親和力受體TrkA。

1.2 動(dòng)物模型的分組及處理方法 對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，應(yīng)用Open-field 法，選擇評分相近的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，共4組，分別為PSD組、腦卒中組、抑郁組及對照組，每組各13 只。PSD組：應(yīng)用線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，每籠飼養(yǎng)1 只，術(shù)后1 周應(yīng)用孤養(yǎng)法與慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激刺激（CUMS）中7 種刺激方式：①禁食（24 h）、②禁水（24 h）、③夾尾（2 min）、④冷水游泳（4℃，5 min）、⑤潮濕墊料、⑥傾斜鼠籠、⑦束縛（1.5 h）。建立PSD 大鼠模型；腦卒中組：應(yīng)用線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，每籠飼養(yǎng)6～7 只；抑郁組：每籠喂養(yǎng)1 只，運(yùn)用孤養(yǎng)法與慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激刺激（CUMS）建立大鼠抑郁模型；對照組：每籠喂養(yǎng)6～7 只，正常飲食及飲水，與模型組同時(shí)進(jìn)行蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法（1）組織制備：取材時(shí)間設(shè)計(jì)在造模后4周，向大鼠腹腔注入1 mL/100 mg 3.6%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將8 只大鼠取出，依據(jù)大鼠解剖立體定向譜圖將100 mg 丘腦底核組織、0.5 cm 海馬CA1、CA3 區(qū)從冠狀面上切取下來。用焦碳酸二乙酯（4℃預(yù)冷）處理標(biāo)本，用水沖洗3 次，將血跡清洗掉，在EP 管中放置，保存在-80℃的冰箱中，或第一時(shí)間在RT-PCR檢測中應(yīng)用。將5 只大鼠取出，在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用，用4%多聚甲醛（有飽和苦味酸）+生理鹽水灌洗，起點(diǎn)為左心室，將丘腦底核組織、海馬CA1、CA3 區(qū)從冠狀面上切取下來，在20%蔗糖溶液中放置，浸泡2 d，在4℃冰箱中沉底，用石蠟包埋方法，進(jìn)行冠狀切片，厚度為10 μm。（2）RT-PCR 檢測海馬和丘腦NGF mRNA 及TrkA mRNA 表達(dá)：將內(nèi)參GADPH、TrkA、NGF mRNA序列從GenBank 里查找出來，引物序列設(shè)計(jì)過程中采用Primer premier 5.0 軟件。用TRIZOL 試劑盒分別提取丘腦和海馬的總RNA，采用紫外分光光度儀對其純度、濃度進(jìn)行測定。將cDNA 合成，在此過程中嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書。在PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中直接應(yīng)用合成的cDNA第一條鏈，操作過程中嚴(yán)格依據(jù)2×PCR Master Mix Kit試劑盒說明書。NGF、TrkA 及GADPH 引物序列與退火溫度見表1。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并在BIO-GEL 凝膠成像儀紫外模式下對凝膠圖片進(jìn)行拍攝，再采用BIO-GEL 凝膠分析系統(tǒng)對各目的基因條帶及吸光度值進(jìn)行測定。校正數(shù)據(jù)后將目的基因/GADPH 計(jì)算出來，設(shè)定為相對表達(dá)量。（3）免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)二部法對各組石蠟切片進(jìn)行染色，一抗為TrkA、NGF 兔抗單克隆抗體（Swiss EPIT MICS），最佳反應(yīng)濃度為1 ∶150。將一抗加入腦的切片中，放置在4℃冰箱中過夜，然后將PV-9000 試劑盒中的試劑1 加入，在37℃溫箱中進(jìn)行30 min 的孵育，漂洗后再將PV-9000 試劑盒中的試劑2（羊抗兔）加入，脫水、透明、封固過程中分別將梯度酒精、二甲苯、中性樹膠充分利用。陰性對照為磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將一抗取代。每組共5 只大鼠，從每只大鼠選取5 張不連續(xù)切片，每張切片用BA300 數(shù)碼照相機(jī)在Motic 顯微鏡下進(jìn)行拍攝，對5 個(gè)視野（400×）進(jìn)行拍照，對丘腦和海馬免疫陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行雙盲計(jì)數(shù)。

表1 NGF、TrkA及GADPH引物序列與退火溫度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（）表示，多組比較用單因素方法分析，組間兩兩比較用LSD-t 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA 表達(dá)比較 PSD組大鼠海馬NGF、TrkA mRNA 表達(dá)低于對照組（P<0.05），見表2。

表2 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA表達(dá)比較（）

表2 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 4組大鼠丘腦和海馬NGF、TrkA 免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較 PSD組大鼠海馬NGF 陽性細(xì)胞數(shù)少于對照組（P<0.05）見表3。

表3 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較如下［個(gè)/視野，（）］

表3 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較如下［個(gè)/視野，（）］

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

腦卒中通常以急性起病，較快出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，是一種常見的腦血管疾病。腦卒中患者最常出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)是偏癱、偏身麻木、偏盲、失語、構(gòu)音障礙、口角歪斜，甚至昏迷、抽搐等不同程度的神經(jīng)功能障礙。臨床上引起腦卒中的病因根據(jù)TOAST分型有5型，其中大動(dòng)脈粥樣硬化型最為常見，其余還包括心源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他明確病因型（如血管炎、血管畸形等）、不明原因型。其中最常見的危險(xiǎn)因素是高血壓；甚至有一部分患者卒中前即患有不同程度的抑郁癥，故有研究認(rèn)為抑郁癥是引起腦卒中［7-9］的危險(xiǎn)因素。卒中后幸存者中>30%［10］的患者患抑郁癥。PSD 不僅會產(chǎn)生情緒低落、主動(dòng)性差、興趣喪失和睡眠障礙等降低生活質(zhì)量的臨床表現(xiàn)［11］，且對卒中預(yù)后神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能恢復(fù)存在負(fù)面影響，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量和滿意度下降，增加社會功能缺陷和病死率［12］。PSD 既是卒中后的常見并發(fā)癥，又是影響卒中預(yù)后的危險(xiǎn)因素，二者互為因果，若未能及時(shí)診療，可造成惡性循環(huán)，給家庭和社會造成沉重負(fù)擔(dān)［13］。

相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明［14］，在PSD 大鼠發(fā)病過程中，NGF mRNA 表達(dá)降低可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PSD組大鼠海馬NGF mRNA 表達(dá)低于對照組，PSD組大鼠海馬NGF 陽性細(xì)胞數(shù)少于對照組，表明PSD大鼠海馬和丘腦神經(jīng)生長因子及其高親和力受體TrkA mRNA 和蛋白表達(dá)降低。可能原因是去甲腎上腺素能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元及其徑路在腦卒中后被破壞，造成神經(jīng)遞質(zhì)低下，進(jìn)而出現(xiàn)抑郁。PSD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)解剖學(xué)、社會心理學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)等諸多因素［15］。神經(jīng)生物學(xué)認(rèn)為PSD 是一種器質(zhì)性抑郁，其解剖通路為腦干中存在5-HT 及NE神經(jīng)元細(xì)胞體，神經(jīng)纖維通過丘腦與基底神經(jīng)節(jié)投射到額葉大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域，調(diào)控人類情緒和情感［16］。