miR-34a蛋白在子宮內膜癌細胞中的表達及其對癌細胞增殖凋亡機制的影響

張碧艷 楊苗 金曉峰

子宮內膜癌作為高發性、病因未明性婦科惡性腫瘤，多見于圍絕經期、絕經后婦女，伴陰道排液、腹部包塊、出血及疼痛等臨床表現。流行病學調查顯示，隨著社會快速發展，人們經濟條件改善，生活方式改變，子宮內膜癌患病率逐年增高，對女性生命健康存在嚴重危害［1］。目前，臨床針對子宮內膜癌形成、進展機制仍未闡明，但隨著分子生物學、基因組織學深入研究發現，miRNA 存在抑癌基因、調控癌基因作用，于子宮內膜癌細胞組織內表達異常，能對癌細胞增殖、凋亡進行調控［2］。而miR-34a 作為miRNA 家族重要成員，與多種腫瘤的細胞增殖、遷移相關，參與腫瘤細胞發育、增殖、分化及凋亡過程［3］。本研究對miR-34a 在子宮內膜癌細胞組織中的表達進行分析，探討其對子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 選擇2018 年4 月至2020 年3 月本院手術切除獲得的子宮內膜癌組織標本30 例、癌旁子宮內膜組織標本30 例，均由病理科醫師通過嚴格的病理實驗鑒定、確診。患者于術前均未行全身治療，手術切除組織樣本后立即置入液氮環境下凍存。本研究經本院倫理委員會審批，患者知情并簽署同意書。

1.2 方法（1）細胞培養、轉染 ①細胞培養：經RPMI 1640 培養基（內含10%胎牛血清）開展人子宮內膜癌細胞Ishikawa 培養，在37 ℃的二氧化碳（濃度5%）培養箱內培養，每間隔2 d 對培養基進行更換，若細胞匯合>80%開展傳代培養。②細胞轉染：于轉染前1 d，將Ishikawa 細胞準確接種在6 孔板內，選擇無抗生素的無菌培養基實施細胞培養；在細胞密度顯示為70%～80%情況下，依據Lipofectamine 2000 試劑盒的說明書實施細胞轉染操作，轉染6 h 后將6 孔板中培養基取出，并加入RPMI 1640 培養基，內含10%胎牛血清。再于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養箱內正常培養。（2）熒光定量PCR 法檢測miR-34a 表達 對總RNA 進行提取，經熒光定量PCR 法檢測子宮內膜癌細胞組織、癌旁細胞組織內miR-34a 表達，嚴格按說明書實施操作。（3）MTT 法檢測子宮內膜癌細胞增殖能力 經MTT法（四唑鹽比色法）對細胞活力進行檢測，即選擇轉染后人子宮內膜癌的Ishikawa 細胞，經0.25%胰酶開展消化離心處理，將5×103個細胞準確接種在96 孔板內，設定每孔為200l，于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養箱內行3～4 h 培養，后于每孔內加入DMSO（150l），充分振蕩5～10 min，使晶體充分溶解，并在酶標儀的490 nm 處對光密度進行測定，繪制MTT 檢測曲線圖。（4）基因分析 經生物信息學技術對miR-34a 和Notch1-3'UTR 間產生的堿基互補關系進行在線預測；并經點突變對Notch1-3'UTR 的3'UTR MUT（突變型載體）實施構建，再將miR-34a mimics、miR-34a 對照物miRNC、Notch1-3'UTR MUT（突變型載體）及MT（野生型載體）分別轉染進Ishikawa 細胞。轉染48h 后對細胞進行收集，并依據雙熒光素酶報告基因測定試劑盒說明書實施操作，對細胞內螢火蟲的熒光素酶、海腎熒光素酶相關活性進行檢測。（5）流式細胞儀測定子宮內膜癌細胞凋亡 即選擇轉染后人子宮內膜癌的Ishikawa 細胞，取0.25%胰酶開展消化離心處理，于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養箱內培養，行12h 細胞同步化處理后，將原培養液更換，并開展相應處理，在24h 后對細胞進行收集，行離心洗滌處理后，依據試劑盒說明書將流式緩沖液重懸細胞加入，并加入Annexin Ⅴ-TITC（5l）混勻，于4℃避光環境下孵育20～30 min，后加入PI 染液（5l），再孵育5 min，經流式細胞儀測定細胞凋亡情況，激發波長為488 nm，設定發射波長為530 nm，補償調節熒光后設置十字門。將Q2+Q4 區域細胞比值代表細胞凋亡率。（6）Western-blot 法測定蛋白表達 對轉染后人子宮內膜癌Ishikawa 細胞進行培養，處理后將蛋白裂解液加入并對細胞蛋白樣品進行收集，定量后將等量蛋白樣品開展SDS-PAGE 電泳分離及轉膜處理，經5%脫脂奶粉行60 min 封閉，并加入稀釋一抗，于室溫下孵育60 min，再經PBS 溶液洗滌，后加入適量化學發光液進行顯色處理，對成像進行拍照，并經相應軟件分析灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以（）表示，用t檢驗；計數資料以n（%）表示，以χ2校驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌細胞組織內miR-34a 表達 經熒光定量PCR 分析發現，子宮內膜癌細胞組織內miR-34a 表達量明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 癌旁組織和子宮內膜癌細胞組織內miR-34a

2.2 miR-34a 靶基因測定結果 經生物信息學技術對miR-34a 和Notch1-3'UTR 間產生的堿基互補關系進行在線預測結果，見圖2。基因分析發現，相較于miRNC 和WT 共 轉 染，miR-34a mimics 和Notch1-3'UTR WT 共轉染的熒光強度顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；但miR-34a mimics 和Notch1-3'UTR MUT 共轉染熒光強度，與miR-NC 和MUT 共轉染熒光強度對比，差異無統計學意義（P>0.05），見圖3。

圖2 靶基因的生物信息學技術在線預測結果

圖3 雙熒光素酶報告基因測定miR-34a靶基因結果

2.3 細胞活力 經MTT 法分析，與miR-NC組比較，miR-34a mimics組細胞培養1 d、2 d、3 d 后活力明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；與miR-34a mimics組比較，miR-34a mimics 聯合Notch1組的細胞活力明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 miR-34a干擾子宮內膜癌Ishikawa細胞活力結果

2.4 子宮內膜癌細胞凋亡結果 經流式細胞術分析發現，相較于miR-NC組，miR-34a mimics組的細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；相較于miR-34a mimics組，miR-34a mimics 聯合Notch1組的細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

圖5 miR-34a 干擾子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡結果

2.5 Ishikawa細胞內Notch1表達 經Western-blot法分析發現，與miR-NC組比較，miR-34a mimics組Ishikawa細胞內Notch1 表達明顯下降，但PARP 降解產物表達明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與miR-34a mimics組比較，miR-34a mimics 聯合Notch1組Ishikawa細胞內Notch1 表達明顯升高，但PARP 降解產物表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；見圖6。

圖6 miR-34a影響子宮內膜癌Ishikawa細胞內Notch1表達結果

3 討論

近年來，隨著子宮內膜癌致癌機制的深入探索，以及分子生物學研究的發展，針對子宮內膜癌早期診斷、分型、治療、預后等的認知不斷進步。其中，各種細胞蛋白、信號轉導通路異常及基因突變已被證實與子宮內膜癌的形成、發展密切相關。與此同時，子宮內膜癌的形成和發展是由多種信號轉導通路及基因異常相互作用，從而形成的一個復雜連鎖的基因蛋白反應過程。miR-34a 作為高度保守miRNA，于哺乳動物體內廣泛分布，存在組織特異性，于肺以外組織內廣泛分布。研究顯示，miR-34a 存在抑癌作用，能抑制肝癌、乳腺癌等相關腫瘤，故認為miR-34a 能明顯影響子宮內膜癌［4-5］。

本研究結果顯示，相較于癌旁組織，子宮內膜癌細胞組織內miR-34a 表達下降。miR-34a 對子宮內膜癌細胞組織增殖明顯抑制，并加快細胞凋亡［6］。研究表明，miR-205 作為miRNA 家族中最為重要的成員之一，于卵巢癌細胞組織內呈高表達，和腫瘤細胞侵襲、轉移存在相關性［7-8］。故抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡是臨床治療腫瘤的關鍵［9］。

大量體外研究顯示，化療藥物可對癌細胞凋亡進行誘導，進而發揮抗腫瘤作用。近年來，隨著臨床深入研究癌細胞增殖、凋亡發現，miR-34a 經對凋亡通路有關基因進行調控，能誘導細胞凋亡［10］。本研究顯示，miR-34a 過度表達對子宮內膜癌細胞組織凋亡存在促進作用，提示miR-34a 過度表達可增加細胞凋亡標志蛋白-PARP 降解產物表達，明確miR-34a 可將細胞凋亡通路激活，加快子宮內膜癌細胞組織凋亡。研究指出，細胞凋亡信號通路較多，Notch1 信號轉導通路主要由CSLD-NA 結合蛋白、Notch 受體及Notch 配體構成，參與細胞增殖、分化活動，能對細胞分化及增殖、凋亡進行調節，影響細胞生理及病理過程［11］。大量研究表明，Notch 信號存在促腫瘤作用，腫瘤細胞組織內Notch 表達明顯高于正常組織，和腫瘤增殖、凋亡關聯密切［12］。本研究經雙熒光素酶報告基因測定實驗明確miR-34a可結合Notch1 3'UTR，對Notch 啟動子活性進行影響。同時，免疫印跡實驗表明，miR-34a 可對Notch1 蛋白表達進行抑制，提示Notch1 為miR-34a 下游靶基因。而MTT、流式細胞凋亡測定實驗發現，Notch1 表達過度可對miR-34a 介導細胞凋亡進行抑制，促進細胞增殖；提示miR-34a 調控子宮內膜癌Ishikawa 細胞增殖、凋亡，主要經干擾靶基因Notch1 蛋白表達［13］。分析miR-34a對子宮內膜癌Ishikawa 細胞增殖、凋亡的調控作用，可能與Notch 通路存在相關性，能為臨床早期診治子宮內膜癌提供理論依據、臨床試驗基礎。但針對Notch1 蛋白對Ishikawa 細胞增殖、凋亡的影響機制仍需進一步明確，有待深入研究Notch1 蛋白和細胞凋亡標志蛋白PARP 降解產物間互相作用，為臨床防治子宮內膜癌提供新選擇［14］。

綜上所述，Notch1 為miR-34a 重要的下游靶基因，miR-34a 經對Notch1 表達進行靶向調控，能對人子宮內膜癌Ishikawa 細胞的凋亡進行誘導，進而阻斷Ishikawa細胞增殖。