超聲波輔助—酶法提取積雪草總苷及其抗腫瘤作用研究

沈 春 陳 文 王湘君 杜長臻 蘇利興 林凌彬 楊順雨海南熱帶海洋學院理學院 海南熱帶海洋學院水產與生命學院

查閱相關大量文獻可知，積雪草在眾多天然藥物中作為一種具有特殊研究意義的藥物，它有著和其他中藥相同的良好藥性，在自身優點方面，積雪草總苷的藥性偏涼，具有清熱解毒的功效，最重要的是它的副作用非常小，這點是很多同類藥物都不具備的，且積雪草中的其他多類成分也有著不同的藥效，這就使得它在藥物研究這一方面具有很高的地位以及研究價值。本文擬用超聲波輔助-酶法來提取積雪草總苷，利用超聲波輔助-酶法的提取優點，獲取積雪草總苷的最佳提取生產工藝。同時，為了充分了解其在藥理方面的作用，對積雪草總苷的抗腫瘤作用也進行了相關研究分析。

1 前言

積雪草，傘形科積雪草屬的干燥全草，主要分布于陜西、四川、云南、海南等多個省區，生長環境要求極低，生性十分強健，而且繁殖速度也非常快，因此它的易獲取性也就不言而喻；積雪草在我國的中藥史上出現的很早，到如今它的很多中藥用途都被前人總結出來，發現它外用和內用皆可。主要用于腹瀉、中暑、解毒、消腫以及跌打損傷等多種常見病癥的治療，用藥范圍十分廣泛[1-3]。積雪草總苷作為積雪草多個主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化以及抗抑郁和一定程度上改善人智力的顯著功效[4-5]；在現代醫學不斷地發展和完善的進程中，積雪草總苷的多種提取方法也不斷地出現，而且其純化方法也逐漸成熟，所以對積雪草總苷的提取工藝以及抗腫瘤機制進行相對研究，有利于它的藥用價值的提升，同時也為積雪草總苷的潛在價值開發提供理論性參考。

2 積雪草總苷的研究現狀

積雪草由于其各種特性，在天然藥物的研究中已成為一項研究熱點，而且在現代臨床醫學中的應用也普及的十分廣泛。癌癥問題在多種疾病問題中名列前茅，成為醫學界的一大難點，因此對積雪草總苷的提取純化工藝與抗腫瘤研究的相關文獻也如雨后春筍般出現。劉友平[6]等以靜態飽和吸附量和洗脫率為參照標準，比較不同種類的大孔樹脂分離和純化積雪草總苷，再對積雪草總苷的洗脫率等作為指標，篩選出最佳樹脂吸附工藝。李濤[7]等先進行單因素試驗，以提取方法為試驗變量，確定積雪草總苷的最佳提取方法為超聲法，再通過正交實驗對影響積雪草苷提取率的四種影響因素進行實驗統計分析得出最優提取工藝條件。杜建平[8]總結出各種影響成丸的因素，并結合動物體的內外胃粘膜表面實驗和體外釋放度兩種測試結果，以最佳處方研制出具有緩釋功能的積雪草總苷素丸，而且產率也十分可觀，為積雪草總苷向產藥的方向發展提供了很大的依據以及相關方法。

3 積雪草總苷的提取方法比較及純化工藝

現如今積雪草總苷的提取方法有酶法、熱回流法、水煎煮法、超臨界萃取法、閃式提取法等多種有效提取方法。酶提取法是天然藥物中最常見的提取方法之一，但酶法提取要求較高，ph要求極為嚴謹精細，有時用單一酶又不能達到較好的結果，必須多種酶同時作用，且用完的酶不能回收，使得提取劑浪費較為嚴重。該法通過酶破壞細胞壁使細胞中所需成分溶于溶劑中，達到提取目的。但不足之處是提取過程中細胞內的蛋白質等其他有效成分也會隨之溢出；熱回流法的過程中成分易被破壞，而且效率也不能達到期望值，產率較低；水煎煮法雖操作過程簡單，且易得到所需產物，但提取的成分雜質較多，包含多種其他成分，使最終產物達不到提取標準；超臨界萃取法萃取率很高且其萃取流體非一次性，可循環使用，但操作過程卻極其復雜，所需設備十分昂貴，耗資過多，而且反應中的條件難以控制，易在實驗過程中產生較大的誤差性；閃式提取法具有成本不高，提取率高，操作性較強等多種優點，但操作危險[9-11]。因此，總結各種提取方法的優缺點，本文則采用超聲波輔助-酶法來提取積雪草總苷，將超聲波法用于輔助酶法，彌補酶法的缺點。超波輔助-酶法首先需進行單因素實驗，比較各種酶的作用，發現纖維素酶提取效果最明顯，因而在積雪草中加入一定量的纖維素酶來破壞積雪草的細胞壁及細胞膜，使有效成分易溶出到提取液中，并在不同的料液比中加入相對濃度的乙醇進行水浴回流加熱，超聲提取出提取液并離心。再進行正交實驗比較酶解溫度和用量、料液比、超聲提取時間對積雪草苷提取率的影響大小關系，最終確定最佳提取工藝并提取出積雪草總苷這種所需成分。積雪草總苷的常用純化工藝包括樹脂吸附法、殼聚糖絮凝法[12]。大孔樹脂廣泛運用于各種天然藥物的成分的分離純化，種類較多，提取成分在純化時可選擇性高，有效成分間的比例及種類可充分的保留。

4 積雪草總苷的抗腫瘤作用

近些年來，惡性腫瘤致死率在眾多病癥中穩居首位，患病率更是快速升高，在天然藥物中尋求和開發抗腫瘤作用的藥物成分，一直是整個醫學界乃至整個社會的焦點和方向。淋巴細胞產生的贅生物細胞群就會形成腫瘤，積雪草總苷是在不影響正常運行的淋巴細胞的前提下，通過抑制腫瘤細胞的增殖起到抗腫瘤的作用。周[13]等以人的胃癌細胞和肝癌細胞等癌癥細胞株作為實驗瘤株，用MTT法檢測這些瘤株的增殖速度受積雪草總苷的影響程度，以及運用流式細胞儀，免疫印跡法等各種醫療器械和醫療手段研究積雪草總苷對腫瘤細胞的周期和凋亡的影響，發現對腫瘤細胞的增殖有著抑制作用。姚錦英[14]利用A459細胞建立裸鼠荷瘤細胞模型并利用HE染色法等一系列實驗和方法，對比模型組發現積雪草總苷不僅能抑制腫瘤細胞的生長還可以令其部分壞死而起到抗腫瘤作用。

5 結語

綜上所述，對積雪草總苷的特殊藥理作用及提取方法有了一定的了解，它在未來醫學上的作用和開發的潛力是毋容置疑的；因此，對積雪草總苷更深層次的研究是必要的，既可以加速突破現有的相關理論范圍，也為后續開發和投入臨床的進程奠定基礎。本實驗選擇超聲波輔助-酶法，通過超聲波以機械手斷優先將細胞壁破碎，加快物質運動分子的運動速率和頻率，使溶劑的滲透性增加，再利用酶對細胞壁進行二次降解，兩者有效結合促進積雪草總苷的溶出效率，達到實驗目的；整個實驗過程耗時少，最終的提取率也比較可觀，實驗結果數據可以為后續研究積雪草總苷的提取提供參考。