17p13.3微缺失/微重復與胎兒臨床表型差異的遺傳學分析
——附五例報告

楊瀅，朱湘玉，王景美，荊秀娟，顧雷雷，劉威，王皖駿，王亞平，李潔

(1.南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院 婦產科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院病理科，江蘇 南京 210008； 3.南京大學醫學院 醫學遺傳學研究室，江蘇 南京 210093)

17p13.3單倍體不足或重復與罕見遺傳病表型發生相關。根據異常染色體片段所含的關鍵基因不同，17p13.3區域微缺失或重復引起的主要表型異常分為米勒·迪克綜合征(Miller- Dieker syndrome，MDS)、孤立性巨腦回畸形(isolated lissencephaly sequence，ILS)[1- 3]、17p13.3微重復綜合征Ⅰ型和17p13.3微重復綜合征Ⅱ型[4- 6]。

基因型- 表型關聯分析研究表明，17p13.3區域是智力殘疾、顱面缺損、癲癇和一些罕見癥狀的致病區域。本研究采用染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis, CMA)發現5個病例17p13.3區域微小基因組拷貝數改變，通過實時熒光定量PCR(quantitative real- time polymerase chain reaction, q- PCR)和熒光原位雜交技術(metaphase fluorescenceinsituhybridization, FISH)，對異常片段的親本來源進行檢測，探討該區域遺傳物質不均衡與臨床表型的關系。

1 資料與方法

1.1 病例一般資料

本研究的5個病例來自南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院產前診斷中心，患兒親屬均簽署了遺傳學檢查知情同意書。其中病例1、2和3是經腹穿刺的羊水標本，病例4是流產胚胎，病例5是引產胎兒皮膚組織。

1.1.1 病例1 G1P0，孕22周，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎之一(選擇性生長受限 Ⅱ 型，胎兒鏡下行減胎術后所留胎兒)。胎兒左側側腦室后角10.4 mm，右側側腦室后角9.2 mm，胎兒大小符合孕周。父母非近親婚配，自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑，無明顯遺傳病家族史。

1.1.2 病例2 G1P0，體外受精(IVF)胎兒，孕22周，超聲檢查胎兒大小符合孕周，有先天性心臟病室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)(圖1A、B)，父母非近親婚配，IVF妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑，無明顯遺傳病家族史。

圖1 病例2胎兒超聲心動圖檢查結果 A.VSD，箭頭所指為室間隔近左室流出道處見回聲失落；B.箭頭所指為穿隔血流信號。RV為右心室，LV為左心室，AO為主動脈

1.1.3 病例3 G2P0，20周胎兒，因孕婦外周血胎兒游離DNA產前檢測(noninvasive prenatal test，NIPT)提示17p13.3缺失行羊膜腔穿刺，超聲檢查胎兒生長發育符合孕周。父母非近親婚配，此次系自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑。孕婦2018年因胎兒先天性心臟病引產1次。孕婦本人順產所生，1歲說話，1歲走路，初中畢業。身高160 cm，體重63 kg，頭圍 55 cm，有輕微特殊面容(雙眼略下斜，鼻梁塌陷寬大，短鼻，鼻孔略上翻，雙耳位低，上唇肥厚，嘴角下彎)，雙手掌紋無特殊，無雙側小指內彎，與人交流略差，生活可自理，輕度智力低下[根據心理教育評定量表(psycho- educational profile，PEP)評估]。配偶無特殊面容，孕婦及配偶胸部CT、腹部超聲、超聲心動圖、血常規、肝腎功能均未見明顯異常。家系其他成員無特殊表現。

1.1.4 病例4 G3P0，孕10周稽留流產組織。孕婦2017年人工流產1次，2018年胚胎停止發育1次(原因不明)。

1.1.5 病例5 G1P0，孕23周引產胎兒，女性，因孕22周超聲檢查提示腹圍相當于20+周(圖2A)、左心發育不良綜合征、左心偏小(圖2B)、主動脈瓣及瓣后狹窄(圖2C)、心軸左偏(圖2D)而引產。引產兒尸檢：體重446 g(體重過輕，小于第1百分位數區間)，其余各項生長參數符合23周胎兒。面容輕度異常(雙眼線下斜，鼻梁塌陷，寬大，短鼻，鼻孔略上翻，雙耳位低，上唇肥厚)(圖3A、B)。未見第5指內彎。左心發育不良(左心室約為右心室1/3大小)，主動脈狹窄(主動脈周徑0.6 cm，肺動脈周徑1.2 cm)，主動脈弓離斷(降主動脈與主動脈弓不連續)。頭部與神經系統無特殊表現。鏡下觀察各重要臟器無特殊表現。胎兒父母非近親婚配，系自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑。男方(父本)的姐姐32歲，智力低下，記憶力差，月經未潮；男方母親有3次人工流產史。

圖2 病例5胎兒超聲檢查陽性結果 A.腹圍151.9 mm(相當于20+周)； B.四腔心切面，左心明顯小于右心； C.主動脈瓣瓣環徑1.96 mm，升主動脈內徑2.84 mm； D.心軸左偏。GA為孕周，RA為右心房，LA為左心房

圖3 病例5 引產胎兒外觀 A.大體觀； B.面部側面觀，輕度異常面容，耳位低

1.2 實驗方法

1.2.1 CMA檢測 在超聲引導下，采集病例1、2、3中孕期羊水10 ml，同時采集胎兒父母的新鮮外周血1 ml(EDTA抗凝)，病例4的樣本為稽留流產的絨毛10 g，病例5的樣本為引產胎兒的皮膚0.5 cm2大小。采用全基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)抽提DNA。病例3的母親存在輕度智力低下以及輕微的特殊面容，進一步應用CMA檢測技術對病例3的父母進行檢測。常規抽提DNA，應用Cyto scan 750 k芯片(Affymetrix，美國)進行全基因組芯片雜交。查閱PubMed數據庫、DGV 數據庫(database of genomic variants)、Decipher數據庫(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)對檢測結果的致病性進行分析。

1.2.2 異常片段親本來源分析 根據CMA檢測結果以及各家系臨床表現，選用不同的檢測技術進行異常片段的驗證和判斷其來源。

q- PCR(SYBR Green法)：設立正常對照(經過CMA檢測驗證的正常男性DNA標本)。根據病例1、2、3的異常片段設計引物，選取片段內基因2個，片段外基因1個(PMP22)，引物設計采用Primer 3工具。試驗儀器采用StepOnePlusTMq- PCR系統(Life Technologies，美國)，內參為DNA拷貝數穩定的GAPDH基因。qPCR引物見表1。

表1 q- PCR引物序列

病例4和5均存在多個片段的異常，涉及除17p13.3缺失外的其他染色體重復，根據CMA檢測結果，分別選用商品化探針(17p13.1，17號ter、10號ter、6號ter)，應用FISH檢測技術對病例4、5父母的外周血染色體進行FISH檢測，判斷是否存在染色體結構異常。

2 結 果

2.1 CMA檢測結果及親本來源分析

見表2。

表2 CMA檢測結果及親本來源分析

5例17p13.3區域DNA片段拷貝數異常病例中，17p13.3微重復綜合征(Ⅱ型)1例(病例1)，臨床意義不明的染色體拷貝數變異(variants of unknown significance，VOUS)1例(病例2)，MDS綜合征3例(病例3、4、5)。病例1的17p13.3微重復為新發突變，17p13.2 p13.3微重復為母源；病例2的17p13.3微重復為母源；病例3的17p13.3微缺失為母源(CMA檢測驗證)；病例4存在6p25.3 1.5 mb重復，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重復，為新發突變。病例5存在10q26.12 q26.3 13.67 mb重復，17p13.3 2.27 mb缺失，來源于t(10；17)的父親。

2.2 結局隨訪

病例1、3、5選擇了終止妊娠。病例2足月順產男孩，出生后因VSD行修補手術，目前1歲半，生長、運動發育正常。病例4為早期胚胎停止發育。

3 討 論

在人類染色體中，17號染色體DNA(基因)序列存在較高密度的重復片段，且包含的基因較多。在17p區域，超過23%的部分是由低拷貝重復序列(low copy repeat，LCR)組成[7]。LCR的存在為非等位同源重組(non allelic homologous recombination，NAHR)的發生提供了可能[8- 10]。染色體17p13.3內發現的較高密度LCR使其成為“重組熱點”，因此在此區段更容易發生NAHR，導致該區域遺傳物質出現缺失和重復。

17號染色體的不穩定性導致了多種疾病，包括腦形態障礙、精神疾病、癲癇和腫瘤的發生[9，11- 13]。17p13.3區域存在4種主要致病性異常，分別是MDS、ILS、17p13.3微重復綜合征Ⅰ型和Ⅱ型。位于染色體17p13.3上的PAFAH1B1、YWHAE和CRK基因是區分的關鍵。PAFAH1B1基因(601545)編碼血小板活化因子乙酰水解酶細胞內Ⅰb亞型的非催化亞單位，其缺失導致經典型無腦回畸形[2]。YWHAE基因(605066)編碼14.3.3蛋白，在神經元遷移和軸突生長中起調節作用。CRK基因(164762)編碼受體信號蛋白，參與顱面發育和神經元遷移[14- 15]。

17p13.3區域的微重復/微缺失綜合征為罕見疾病，其臨床表型的大部分信息是基于對個案分析獲得。本研究中的5例胎兒/胚胎和病例3的母親均涉及17p13.3區域的微缺失或微重復，根據所涉及的關鍵基因(PAFAH1B1、YWHAE、CRK基因)，對5個病例的CMA檢測結果進行了分析及遺傳學診斷(表2)。檢出多為MDS(4例：病例3及其母親、病例4、病例5)，其中1例MDS病例涉及了PAFAH1B1基因(病例4，早期胚胎停止發育)，其余3例來自2個家系，均未涉及PAFAH1B1基因，考慮為PAFAH1B1遠端的MDS。病例1為17p13.3微重復綜合征Ⅱ型，病例2 為VOUS。

文獻中有關PAFAH1B1遠端MDS的相關研究較少[2，5，16- 23]，國內見2篇報道[16，23]，涉及28個病例[16，20，23]。將本研究中提供詳細表型的病例3、病例3的母親及病例5與檢索獲得的病例進行了整合分析(計31例)，其中面部異常26例(主要面部特征包括鼻根寬大、短鼻、鼻孔上翻、大而突出的上嘴唇、低耳位)，5例未提供信息；輕中度智力低下24例，7例胎兒無法提供信息；神經系統未見明顯異常12例，腦白質異常14例，未提供信息5例，胎兒期表現為明顯異常的2例；宮內發育遲緩13例，出生后生長發育遲緩22例；其他系統未見明顯異常17例，先天性心臟病6例(動脈導管未閉3例，VSD 2例，左心發育不良1例)；第5指內側彎8例。提示，相較于其他的MDS患者，PAFAH1B1遠端的MDS癥候群患者存在MDS的面容特征，但臨床表現相對較輕，可以沒有明顯的神經系統結構異常。基于檢測手段的局限性，絕大部分該類患者在胎兒期缺乏特征性表現。

病例4是稽留流產標本，CMA檢出6p25.3 1.5 mb重復，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重復，系新發。6p末端微重復以及17p13.2p12重復的相關研究報道極少，截至2021年4月，Decipher 數據庫中僅有3例類似片段的6p末端重復相關病例(290372、314724、386921)，2例類似片段的17p13.2p12重復病例(394097、396211)，且均無早期胚胎停止發育的臨床表現。關于MDS患者早期胚胎停止發育研究報道有4例[24- 27]，但相互之間觀點存在差異。其中一項研究分析了14個涉及MDS的家族中妊娠情況，研究顯示MDS胎兒的自然流產率與人群自然流產率沒有顯著差異[25]。病例4異常片段所涉及的基因包括6p25.3重復區域中的FOXQ1(612788)、FOXC1(601090)，17p13.3p13.2缺失區域中的MNT(603039)、PAFAH1B1(601545)、CLUH(616184)、P2RX5(602836)、HASPIN(609240)，以及17p13.2p12區域中的PFN1(176610)、CTDNEP1(610684)、KCTD11(609848)、TP53(191170)、KDM6B(611577)。鑒于上述基因在胚胎發育中的重要作用，其拷貝數異常可能與病例4早期胚胎停止發育的發生有關。

病例5除MDS常見面部異常外，存在左心發育不良綜合征，體重過輕。CMA檢出10q26.12q26.3 13.67 mb重復，17p13.3 2.27 mb缺失，來源于其攜帶t(10；17)平衡易位的父親。考慮10號染色體和17號染色體的不平衡現象是其家中其他智力低下患者的致病原因。與本中心已報道的MDS患兒及其同胞MDS胎兒[16]的10q26.13q26.3 9.73 mb重復、17p13.3 1.68 mb缺失相比，兩者所涉及的遺傳物質異常區段存在相似性，而臨床表現存在差異(已報道的病例無先天性心臟病的臨床表現)。Decipher數據庫中涉及左心發育不良的17p13.3缺失病例僅有1例(395121)。病例5同時存在10p26區域拷貝數異常，涉及ATE1基因(607103)。Kwon等[28]證明，在ATE1基因敲除的小鼠胚胎心臟中，約90%左右心室心肌發育不良。因此考慮病例5攜帶的10p26末端部分三體可能參與了其左心發育不良的形成。

本研究依托于多種遺傳學檢測方法，明確了5例胎兒的遺傳學基礎以及親本來源，為遺傳咨詢提供了確切的遺傳學證據。對4例MDS患者的表型和基因型進行了相關分析，為PAFAH1B1遠端的MDS癥候群提供了新的案例。