蛋白質(zhì)組學(xué)探索乳腺癌相關(guān)差異表達(dá)蛋白的研究進(jìn)展

孫雨露，管憶楠，姚永忠

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008; 2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)2020年最新統(tǒng)計顯示，女性乳腺癌現(xiàn)已超過肺癌，成為全球第一大癌種[1]。許多基因組或轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)揭示了乳腺癌轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良的遺傳特征[2- 4]。但是人類乳腺癌組織中蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并不完全一致，這體現(xiàn)了對疾病調(diào)控基因進(jìn)行蛋白水平測量的價值，畢竟蛋白質(zhì)才是細(xì)胞中真正的效應(yīng)分子[5]。近年來，通過基于質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)法的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以揭示乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制，篩選乳腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物和分子靶點，蛋白質(zhì)組學(xué)已逐漸成為乳腺癌早期診斷、治療及預(yù)后評估的有效方法。作者對近年來蛋白質(zhì)組學(xué)在乳腺癌研究中取得的進(jìn)展作一綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

組學(xué)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué))方法論可以幫助我們更全面更細(xì)致地認(rèn)識復(fù)雜的生物系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)是在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的基礎(chǔ)上迅速發(fā)展的新興學(xué)科，它旨在研究蛋白質(zhì)在任何階段的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和修飾，可以通過結(jié)合生物信息學(xué)工具來闡述涉及復(fù)雜疾病的生化過程和發(fā)展規(guī)律，對疾病的早期診斷、治療、預(yù)后判斷有指導(dǎo)作用[6- 7]。

最初，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)和蛋白質(zhì)印跡只能被用于特定蛋白質(zhì)的分析，而十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)、二維凝膠電泳(two- dimensional gel electrophoresis, 2- DE)及二維差分凝膠電泳(two- dimensional differential gel electrophoresis, 2D- DIGE)技術(shù)可被用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品檢測[8]。近年來，由于MS技術(shù)的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得快速進(jìn)展，高通量高靈敏度的表面增強激光解析電離- 時間飛行質(zhì)譜(surface- enhanced laser desorption/ionization time- of- flight, SELDI- TOF- MS)和基質(zhì)輔助的激光解析電離- 時間飛行質(zhì)譜(matrix- assisted laser desorption/ ionization time- of- flight, MALDI- TOF- MS)使用最為廣泛，使蛋白質(zhì)大分子快速分析鑒定成為可能[9]。而后定量技術(shù)例如同位素親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope- coded affinity tag，ICAT)、細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)以及同位素標(biāo)記相對和絕對定量/串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification/tandem mass tags，iTRAQ/TMT)相繼出現(xiàn)，可以將混合體系中所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的鑒定和定量，更加簡單、準(zhǔn)確、快速[8]。

目前蛋白質(zhì)組學(xué)已用于各類腫瘤，包括肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等復(fù)雜蛋白生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)研究。在乳腺癌中，通過對臨床上多種樣品如組織標(biāo)本、血清、乳汁溢液、唾液和尿液等進(jìn)行微量檢測，從而篩選得到能夠用于早期診斷、治療監(jiān)測以及預(yù)后判斷的乳腺癌潛在生物標(biāo)志物。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選組織中的差異表達(dá)蛋白

目前，臨床上仍主要依靠雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的免疫染色結(jié)果作為乳腺癌分類的基礎(chǔ)，用以指導(dǎo)治療[10]。2016年Tyanova等[11]分析了40個不同亞型的乳腺癌隊列，使用SILAC技術(shù)對10 000多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，這些數(shù)據(jù)提供了對不同亞型進(jìn)行辨別的分子細(xì)節(jié)，以及可轉(zhuǎn)化為臨床用途的預(yù)測特征，作者認(rèn)為將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)整合到轉(zhuǎn)化癌癥研究中，有助于開發(fā)新型乳腺癌標(biāo)志物并確定潛在的治療靶標(biāo)。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析協(xié)會通過基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析了一組包含77個組織樣本的隊列，使用iTRAQ定量鑒定出了12 553個蛋白質(zhì)和33 239個磷酸化位點，綜合分析可以深入了解體細(xì)胞突變的功能后果，除了HER2，還鑒定了其他與擴增子相關(guān)的高度磷酸化激酶，包括CDK12、PAK1、PTK2、RIPK2和TLK2，或許可以確定治療靶標(biāo)[12]。在此基礎(chǔ)上，Yanovich等[13]整合了發(fā)表的和未發(fā)表的共3個數(shù)據(jù)集生成了一個完整的乳腺癌及健康樣本數(shù)據(jù)集，利用基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析對130多個臨床乳腺樣品進(jìn)行了研究，證明了不同乳腺癌亞型之間的腫瘤異質(zhì)性，并且鑒定出兩個Luminal A亞型，其中之一具有與三陰性乳腺癌相關(guān)信號蛋白活性增加的特征，從而提示Luminal A腫瘤的新型亞型。研究表明基于蛋白質(zhì)表達(dá)對管腔性乳腺癌進(jìn)行分類可能為更全面的臨床評估奠定基礎(chǔ)，從而有利于臨床醫(yī)生給出最適合的治療方案[11，13- 14]。最近，Krug等[15]對122個原發(fā)性乳腺癌樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，提供了HER2擴增子的詳細(xì)分析，篩選了可以從免疫檢查點治療中受益的腫瘤亞群，并且可以更準(zhǔn)確地評估Rb的狀態(tài)，以預(yù)測CDK4/6抑制劑的反應(yīng)性。此外，磷酸化和乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)分析為全面了解乳腺癌的生物學(xué)特征提供了更多的信息。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選血清中的差異表達(dá)蛋白

臨床上經(jīng)常應(yīng)用不同的血清蛋白指標(biāo)如CA125、CA199、AFP等來監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是在乳腺癌中還沒有找到特異的靈敏的血清標(biāo)志物并將其應(yīng)用于臨床診療過程中。近來血清蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，為乳腺癌的早期診斷提供了新的思路和技術(shù)路線。蛋白組學(xué)的測定發(fā)現(xiàn)了不同亞型乳腺癌中的血清差異表達(dá)蛋白，這表明血清也可以幫助鑒別乳腺癌的亞型，有助于早期診斷和更好地治療該疾病[16]。Yigitbasi等[17]使用SELDI- TOF- MS技術(shù)同時分析了乳腺癌、良性腫瘤患者和健康人的血清，預(yù)測了4個蛋白峰作為生物標(biāo)志物，結(jié)合CA15- 3指標(biāo)后可以協(xié)助診斷乳腺癌，該模型具有良好的敏感性和特異性。Fredolini等[18]將親和水凝膠納米顆粒與LC- MS/MS分析結(jié)合使用，鑒定了浸潤性導(dǎo)管癌病人血清中的56個候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，將這些蛋白質(zhì)與其他癌癥病人血清中增加的蛋白進(jìn)行比較，篩選出32種蛋白質(zhì)，構(gòu)建的診斷模型或許可以聯(lián)合乳腺鉬靶來檢測早期乳腺癌。也有研究通過不同的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了復(fù)發(fā)性和非復(fù)發(fā)性乳腺癌患者的血清樣品，發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)性乳腺癌中表觀遺傳蛋白包括組蛋白去乙酰化酶(HDAC)5、HDAC7、HDAC9、小類泛素化修飾蛋白1(SUMO- 1)、胚胎干細(xì)胞表達(dá)Ras(RASE)以及促炎蛋白血清淀粉樣蛋白A(SAA)、白介素18(IL- 18)的水平上調(diào)[19]，這些蛋白或許可以成為疾病復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。另外，迄今為止，男性乳腺癌發(fā)病率低，相關(guān)研究也較少，Zografos等[20]對11例男性乳腺癌和8例健康人的血清進(jìn)行MALDI- TOF- MS分析，描述了男性乳腺癌患者的血清蛋白譜，對乳腺癌血清蛋白譜進(jìn)行了補充。

血清蛋白質(zhì)組學(xué)在乳腺癌治療以及治療效果預(yù)測、預(yù)后判斷等方面應(yīng)用前景廣闊。Walaszczyk等[21]在放化療治療前和治療結(jié)束后1年(未發(fā)現(xiàn)治療失敗的臨床癥狀)時收集病人血清樣本進(jìn)行LC- MS/MS和2D- PAGE分析，其蛋白相對量在治療前和治療后樣品之間有顯著差異，然而長期隨訪后發(fā)現(xiàn)在治療失敗組中這種變化更為明顯。該研究表明治療前后觀察到的血清蛋白質(zhì)組的特定模式變化可用于監(jiān)測治療反應(yīng)，也可用于評估長期預(yù)后。Yang等[22]對曲妥珠單抗治療耐藥和有反應(yīng)的HER2陽性乳腺癌患者治療前的血清蛋白質(zhì)進(jìn)行了TMT標(biāo)記的多重定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了18種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并最終證實3種蛋白質(zhì)(SRGN、LDHA和CST3)與曲妥珠單抗治療耐藥相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)可以提高基于曲妥珠單抗治療的臨床實用性。抗癌藥物的副作用是導(dǎo)致乳腺癌治療效果不滿意的原因之一。有研究[23]應(yīng)用基于MS法的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)評估了血清外泌體中蛋白質(zhì)含量與紫杉烷類誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計顯示12種蛋白質(zhì)的特征導(dǎo)致有周圍神經(jīng)病變和沒有周圍神經(jīng)病變的兩組病人基線血清樣品之間的明顯分離，表明基線樣品可以預(yù)測隨后的神經(jīng)毒性。所以，通過恰當(dāng)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)，從患者中獲取血清以連續(xù)監(jiān)測不同藥物的治療效果，了解導(dǎo)致毒性增加的因素，將提供進(jìn)行更多的個性化治療，以優(yōu)化治療效果并改善乳腺癌患者的長期生活質(zhì)量。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選乳頭抽吸液中的差異表達(dá)蛋白

乳腺液在乳腺導(dǎo)管中產(chǎn)生，其中含有乳腺上皮細(xì)胞[24]，可通過真空抽吸收集，相對難以獲得并且會引起患者不適，所以乳頭抽吸液(nipple aspirate fluid, NAF)蛋白質(zhì)組學(xué)并不是目前的主流研究方向，近年來相關(guān)研究也較少。Brunoro等[25]通過SDS- PAGE和2D- DIGE評估了來自7例單側(cè)乳腺癌患者的14個配對NAF樣本，結(jié)果表明，不同患者之間擁有非常不同的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，侵襲性較弱的腫瘤患者的NAF蛋白表達(dá)譜具有相似的均一性，更具侵襲性的腫瘤患者之間則具有異質(zhì)性。在此基礎(chǔ)上，2019年Brunoro等[26]對乳腺癌及其配對的對照NAF樣本進(jìn)行分析，總共鑒定和定量了1 227種蛋白質(zhì)，其中87種差異顯著，并且在這些差異蛋白中發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞- 基質(zhì)溝通、糖酵解(Warburg效應(yīng))和免疫系統(tǒng)激活的蛋白質(zhì)含量較高。該研究加深了人們對腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識，有助于了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，評估預(yù)后[26]。Shaheed等[27]從8個NAF樣品的2D- LC/MS分析中總共鑒定出1 990種獨特的蛋白質(zhì)，其中許多是已建立的癌癥相關(guān)標(biāo)記，這些蛋白質(zhì)在組織穩(wěn)定性、細(xì)胞黏附和細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，未來的NAF蛋白質(zhì)組學(xué)分析將致力于研究癌細(xì)胞增殖并遷移到周圍的正常組織環(huán)境時，蛋白質(zhì)的變化是否與基質(zhì)破壞和降解有關(guān)。

5 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選唾液中的差異表達(dá)蛋白

唾液是一種非侵入性生物流體，可以反映生命個體局部和整個系統(tǒng)健康狀況，唾液收集對患者而言安全無痛苦，并且方便、容易。唾液蛋白質(zhì)組學(xué)是乳腺癌診斷的一個新領(lǐng)域。Giri等[28]對轉(zhuǎn)移性乳腺癌和卵巢癌進(jìn)行全唾液蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，共鑒定出646種蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌和卵巢癌患者中均發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白如coronin- 1A，、TPT- 1、VASP、HSP90α、cofilin及Arp 2/3，這些蛋白和癌癥的嗜有機性相關(guān)，另外，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中大多數(shù)上調(diào)的蛋白質(zhì)在功能上互相關(guān)聯(lián)，這表明它們比卵巢癌更具侵襲性。

6 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選尿液中的差異表達(dá)蛋白

在傳統(tǒng)觀念中，尿液檢查一般是用來幫助診斷泌尿系統(tǒng)疾病的，與之相關(guān)的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)備受關(guān)注[29- 30]，而在乳腺癌研究中這項技術(shù)才剛剛起步。一項針對148名女性的研究[31]顯示，尿液中MMP- 9和ADAM- 12含量高的女性發(fā)生非典型增生的可能性比正常對照組高5倍，發(fā)生小葉癌的可能性高13倍，這兩個指標(biāo)可以用來預(yù)測發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險。另有研究[32]表明，使用無標(biāo)記LC- MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測到的大量豐富的乳腺癌尿蛋白都是分泌蛋白，在鑒定出的59種重要尿蛋白中，揭示了13種新型上調(diào)蛋白的列表，可用于創(chuàng)建一組靶標(biāo)，構(gòu)成尿液篩查“試紙”測試的一部分，以檢測乳腺癌。Gajbhiye等[33]則使用了基于凝膠和無凝膠的互補定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，找到了一組尿蛋白標(biāo)志物，可以將HER2亞型乳腺癌與健康對照區(qū)分開，這些蛋白可以成為無創(chuàng)性候選靶標(biāo)并幫助我們了解乳腺癌的病理生理過程。

7 展 望

最近，隨著技術(shù)的進(jìn)步，基于MS法的蛋白質(zhì)組學(xué)研究蓬勃發(fā)展，經(jīng)過篩選的差異表達(dá)蛋白不僅可以重新定義不同的乳腺癌亞型，還可以作為乳腺癌的篩查指標(biāo)和治療靶點，實現(xiàn)乳腺癌早期診斷、精準(zhǔn)治療的目標(biāo)。但是，由于臨床樣本不易得到，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)精湛，價格昂貴，大規(guī)模的臨床研究相對少見，所以雖然目前已經(jīng)有很多乳腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果，仍需擴大樣本進(jìn)行多中心的實驗進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果，才能真正應(yīng)用于臨床，惠及更多的乳腺癌患者。