果園生混合干草對羔羊胃腸道細菌多樣性的影響

李騰飛，劉崇義，靳旭妹，曹馨悅，陳新義，王瑩瑩，龍明秀

（西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100）

青干草作為反芻動物及其他草食動物重要的飼糧來源，直接影響動物的生長發育和畜產品質量[1]。近年來，隨著人類對高品質畜產品的需求不斷增加[2-3]，草地的可持續利用和優質飼草的供應逐漸成為養殖戶面臨的首要問題[4-5]，“果–草–畜”復合系統使林果業與養殖業有機結合，符合可持續發展與生態種養的總體要求，其生產的干草是反芻動物的優質飼草來源。

反芻動物胃腸道內細菌微生物通過降解宿主本身難以消化的纖維素、半纖維素和木質素等物質，為機體提供生長所需的能量和養分。日糧通過影響動物胃腸道微生物菌群組成和多樣性進而對胃腸道生理指標的變化產生影響，如pH 等。據報道[6]，牦牛日糧由高纖維向高谷類轉變時，瘤胃微生物代謝產生大量酸性物質，導致pH 下降，影響瘤胃微生物多樣性和群落結構。Xue 等[7]研究指出在中國青藏高原地區不同飼養方式對耗牛瘤胃微生物具有顯著影響。Henderson 等[8]通過分析全程飼喂不同日糧的32 種反芻動物的瘤胃菌群組成發現，優勢菌群主要以普氏菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)為主。綜上所述，飼糧組成的多樣化對動物胃腸道菌群結構和組成具有重要的影響。

在耕地有限和國家實行“雙減一增”政策的大背景下，如何提高農區土地利用效率，發展高效安全的畜牧業成為當前研究的重要課題。研究發現，“果–草”復合系統能明顯提高果實可溶性糖、可溶性固形物、維生素C 含量[9]、土壤酶活性和微生物數量[10]。但對于“果–草–畜”模式下草對反芻動物胃腸道細菌群落多樣性影響的研究相對較少。本研究基于16S rDNA 測序技術平臺，通過飼喂不同果園混合干草對薩能奶山羊公羔瘤胃和腸道菌群的組成、菌群多樣性及優勢菌群的變化進行分析，為渭北旱塬“果–草–畜”生態種養循環提供可靠的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗在渭南市蒲城縣海源種植家庭農場進行。選取健康的2月齡薩能奶山羊公羔(11.48 ±0.55 kg) 24 只，隨機分為4 組(按體重相近的原則)，每個處理3 個重復，每個重復2 只公羔，試驗期85 d(預飼期15 d、正試期70 d)。試驗采取單欄飼養，其中，對照組羔羊飼喂當地養殖戶配制的混合粗飼料[主要為玉米(Zea mays)秸稈、小麥(Triticum aestivum)秸稈、紫花苜蓿(Medicago sativa)以及少量田間雜草]，其他3 個組為試驗組，分別飼喂燕麥草(Avena sativa) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅰ組)、多年生黑麥草(Lolium perenne) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅱ組)、毛苕子(Vicia villosa) + 多年生黑麥草(Ⅲ組)混合干草。

試驗日糧配制依照《肉羊飼喂標準(NY/T 816–2004)[11]》進行配制。飼喂前將各組飼草切短(長度為3～5 cm)后按1 ? 1 比例混合后組成混合干草。精料補充料為：玉米68%、麩皮3%、豆粕24%、小蘇打1%、預混料4% (每千克預混料含維生素A 2 640 IU、維生素D 340 IU、鐵60.00 mg、鋅48.00 mg、錳48.00 mg、維生素E 26.00 mg、銅12 mg、鈷0.12 mg、碘0.30 mg、硒0.36 mg)。精料飼喂量為羊只體重的0.8%。精飼料與粗飼料分開飼喂，保證料槽中有10%的剩料。4 組日糧精粗比一致，營養水平如表1所列。

表1 各組混合干草的營養水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient contents of mixed hay in each group (dry matter basis)

1.2 飼養管理

試驗前，對試驗羊舍進行清理和消毒，并對所有試驗羊進行防疫和體內驅蟲，試驗期間所有試驗羊均單欄飼喂。每日08:30 和16:30 飼喂，并確保第2日上午飼喂前，料槽內仍有10%左右剩料。試驗期間，公羔自由采食、自由飲水，及時打掃羊舍，對羊圈定時消毒、通風。

1.3 瘤胃及腸道內容物的采集與處理

試驗期結束后，每組選擇3 只體重相近的試驗羊進行屠宰，屠宰后立即采集瘤胃及盲腸內容物，并分別置于5 mL 的凍存管中，?80 ℃冰箱保存，用于瘤胃和腸道細菌微生物區系測定。

1.4 瘤胃微生物和腸道微生物的16s rDNA 測定

使用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒提取細菌總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 提取質量，紫外分光光度計對DNA定量。使用341F (5′-CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVG GGTATCTAATCC-3′) 引物擴增16S rDNA(V3+V4)可變區[12]。PCR 擴增程序和步驟與Li 等[13]研究論文一致，并由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。

1.5 數據處理

采用Excel 2010 對數據進行整理，SPSS 23.0 軟件進行統計分析，結果以“平均數 ± 標準差(mean ±SD)”表示，在0.05 和0.01 水平上進行方差分析。用QIIME 2 程序分析α 多樣性和β 多樣性，用R 3.5.2軟件包繪制圖像。序列比對采用QIIME 2 插件特征分類器，比對數據庫為SILVA 和NT-16s，以SILVA數據庫注釋結果為準，其他圖由Origin 2018 進行繪制。

2 結果與分析

2.1 不同混合干草對腸道菌群多樣性的影響

2.1.1 混合干草對腸道菌群Alpha 多樣性的影響

通過Venn 圖(圖1) 呈現出各處理組共有和特有 的feature 數目，共檢測到5491 個feature 數目。不同混合干草組(Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和CK 組)的feature 數目分別為1 380、2 068、857 和1 186。總體來看，Ⅰ組和Ⅱ組有著較高的feature 數目。

圖1 混合干草盲腸微生物菌群的feature 數目Figure 1 Number of intestinal microbial flora of mixed hay

腸道細菌的多樣性分別用Shannon 指數、Simpson指數和Chao1 指數來解釋(表2)，Ⅱ組的Chao1 指數和Shannon 指數顯著高于其他組(P< 0.05)。且各處理組的Simpson 指數顯著高于對照組(P< 0.05)。各組中的覆蓋度均接近于99%，說明對腸道微生物具有較高的覆蓋度。綜合結果表明，Ⅱ組和Ⅰ組中羊腸道微生物具有較高的Alpha 多樣性。

表2 混合干草對盲腸菌群Alpha 多樣性的影響Table 2 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of intestinal flora

2.1.2 混合干草對山羊盲腸菌群Beta 多樣性的影響

對不同樣品基于UniFrac 的非加權主坐標分析(PCoA) (圖2b)，第1 主坐標(PCoA1) 和第2 主坐標(PCoA2)的貢獻率分別為26.35%和15.61%。4 種不同飼養模式下各腸道樣品完全分離，無交叉現象，同組樣品具有明顯的聚集性。基于UniFrac 的非加權距離的UPGMA 聚類圖(圖2a)可以看出，各組樣品聚類情況較好，每組可單獨聚為一類，可以看出組內樣品相似度高于組間，說明不同混合干草飼喂模式下山羊腸道微生物存在差異。

圖2 混合干草對盲腸菌群Beta 多樣性的影響Figure 2 Effects of mixed hay on the beta diversity of intestinal flora

2.1.3 混合干草對山羊腸道菌群組成影響分析

根據物種注釋結果顯示，薩能奶山羊公羔盲腸細菌一共檢測到27 門(圖3)，可以看出，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、藍藻菌門(Cyanophyta) 和擬桿菌門(Bacteroidetes)等是腸道微生物中相對豐度較高的細菌。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組厚壁菌門的相對豐度顯著高于CK 組(P< 0.05)，大小依次為Ⅰ組> Ⅱ組 >Ⅲ組 > CK 組；CK 組中，變形菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)；Ⅱ組中擬桿菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)。在屬水平上(圖3)，豐度較高的菌有羅姆布茨菌、勞森氏菌屬、梭狀芽胞桿菌、克里斯滕森菌屬R7、瘤胃球菌屬_NK4A214。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中羅姆布茨菌、梭狀芽胞桿菌的相對豐度顯著高于CK 組(P< 0.05)；而勞森氏菌屬則顯著低于CK 組(P< 0.05)。Ⅱ組和CK 組中克里斯滕森菌屬R7 的相對豐度顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P< 0.05)。

圖3 門、屬水平的盲腸細菌群落組成Figure 3 Composition of the intestinal bacterial communities in goats at the phylum and genus levels

2.2 混合干草對瘤胃菌群多樣性的影響

2.2.1 混合干草對瘤胃菌群Alpha 多樣性的影響

通過Venn 圖(圖4) 呈現出各處理組共有和特有 的feature 數目，共檢測到13 055 個feature 數目。不同混合干草(Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和CK 組)的feature數目分別為3 819、3 272、3 423 和2 541。總體來看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組均有著較高的feature 數目，從而推斷出使用果園優質混合干草飼喂山羊，使其瘤胃微生物具有較高的多樣性。

圖4 不同混合干草的瘤胃微生物菌群feature 數目Figure 4 Number of rumen microbial flora of different hay mixtures

Ⅰ組和Ⅲ組的Chao1 指數高于其他組，但不顯著(P> 0.05)。且飼用果園混合干草各組的Shannon指數高于對照組，均沒有達到顯著差異(P>0.05)。4 組中的覆蓋度指數均接近于99%，說明對瘤胃微生物具有較高的覆蓋度。綜合結果表明，Ⅲ組和Ⅰ組羊瘤胃微生物具有較高的Alpha 多樣(表3)。

表3 混合干草對瘤胃菌群Alpha 多樣性的影響Table 3 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of rumen flora

2.2.2 混合干草對瘤胃菌群Beta 多樣性的影響

對不同樣品基于UniFrac 的非加權主坐標分析(PCoA) (圖5b)，第1 主坐標(PCoA1) 和第2 主坐標(PCoA2)的貢獻率為16.69%和13.66%。4 種不同混合干草飼喂下各瘤胃樣品完全分離，無交叉現象，同組樣品具有明顯的聚集性。基于UniFrac 的非加權距離的UPGMA 聚類圖(圖5a)可以看出，每組樣本的聚類性都很好，而且每組都可以被分為一個單獨的組。綜合結果表明，組內樣本的相似度高于組間樣本的相似度，不同混合干草飼喂下羔羊瘤胃微生物存在差異。

圖5 混合干草對瘤胃菌群Beta 多樣性的影響Figure 5 Effects of mixed hay on the rumen bacterial Beta diversity

2.2.3 不同混合干草對瘤胃菌群組成分析

根據物種注釋結果(圖6 )，薩能公羔瘤胃細菌共檢測到21 門(phyla)，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)、變形菌門(Proteobacteria)是瘤胃微生物中相對豐度較高的細菌。Ⅲ組中擬桿菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)，但厚壁菌門和纖維桿菌門的相對豐度卻低于其他3 組，且與Ⅰ組和Ⅱ組呈顯著性差異(P< 0.05)；螺旋體門則無顯著性影響(P> 0.05)；Ⅱ組的變形菌門相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)。在屬水平上，普氏菌屬(Prevotella)、理研菌科(Rikenella)RC9、纖維桿菌屬(Cellulomonas) 和克里斯滕森菌屬(Christensenella) R7 等屬為瘤胃細菌群落中的優勢菌屬。其中，Ⅲ組普氏菌屬的相對豐度顯著高于其他組(P> 0.05)；Ⅱ和Ⅲ組中理研菌科RC9 的相對豐度顯著高于CK 組(P> 0.05)，而纖維桿菌屬則剛好相反；克里斯滕森菌屬R7 各組間無顯著差異。

圖6 門、屬水平的瘤胃細菌群落組成Figure 6 Composition of the goat rumen bacterial communities at the phylum and genus levels

3 討論

3.1 混合干草對羔羊瘤胃和盲腸菌群多樣性的影響

細菌群落的豐富度和均勻度等指標可以通過樣品中的feature 數目和Alpha 多樣性分析來表示。反芻動物瘤胃微生物多樣性與日糧組成、健康狀態及管理等因素密切相關，而飼糧組成是影響群落多樣性及結構的重要因素[14-15]。日糧成分越復雜，瘤胃微生物多樣性就越高[16]，粗蛋白更有利于瘤胃微生物的分解利用[17]。本研究瘤胃樣本與CK 相比，Ⅰ組(3 819)、Ⅱ組(3 272)和Ⅲ組(3 423)均有著較高的feature 數目。腸道作為大量微生物存在的棲息地，形成了復雜獨特的腸道微生態系統[18]，且作為宿主生命的有機組成部分，對其生長發育具有非常重要的影響[19]。本研究腸道樣品中Ⅰ組(1 380) 和Ⅱ組(2 068)有著較高的feature數目，這與Zheng 等[20]在日糧中添加菊苣(Cichorium intybus)草料增加雞腸道微生物群落多樣性而有益于腸道健康研究結果一致。總體來看，使用紫花苜蓿 + 多年生黑麥草和紫花苜蓿 + 燕麥混合干草飼喂羔羊，使其胃腸道細菌微生物有著較高的多樣性。基于Beta 多樣性對瘤胃和盲腸菌群進行分析，結果發現每組均單獨聚為一類，組內樣品相似度高于組間，說明不同混合干草飼喂下羔羊瘤胃和盲腸細菌群落均存在差異。劉桂芹等[21]研究發現飼喂方式對驢盲腸細菌群落多樣性，且各組單獨聚為一類，與本研究結果相同。同樣，不同料重比的豬基于Beta 多樣性的腸道微生物結構存在顯著差異[22]。

3.2 混合干草對羔羊瘤胃和盲腸菌群結構的影響

在腸道細菌群落中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組厚壁菌門的相對豐度顯著高于CK 組，其大小依次為Ⅰ組 >Ⅱ組 > Ⅲ組 > CK 組；Ⅱ組的擬桿菌門相對豐度顯著高于其他3 組。大量研究結果表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物腸道菌群中的優勢菌群[23-24]，厚壁菌能促進腸道微生物分解纖維素，類桿菌是促進碳水化合物利用的優勢菌群[25-26]。本研究中，飼用果園混合干草各組與對照組相比在厚壁菌門相對豐度占比中凸顯出了絕對優勢，其分別占Ⅰ組(92.77%)、Ⅱ組(87.74%)和Ⅲ組(76.98%)；而飼用紫花苜蓿 + 多年生黑麥草混合干草(Ⅱ組)，在擬桿菌門相對豐度中占有一定優勢，其相對豐度達到了5.16%。與吳海麗[27]在不同季節圈養巖羊腸道微生物厚壁菌門72.73%、擬桿菌門16.61%的含量基本一致。變形菌門是中除包含纖維素降解菌、半纖維素降解菌、蛋白質降解菌等以外，還包含很多如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等致病菌，容易引起動物腹瀉等疾病[28]。本研究中，對照組中的變形菌門相對豐度顯著高于其他3 組，這表明飼用果園優質混合干草對平衡腸道菌群具有重要的作用。

在瘤胃細菌多樣性中，薩能奶山羊公羔瘤胃細菌在門水平共檢測到21 種，擬桿菌門(38.28%～54.93%)、厚壁菌門(32.65%～42.77%)、纖維桿菌門(2.20%～8.94%)、螺旋體門(2.97%～5.35%)、變形菌門(1.20%～2.91%)是瘤胃中高豐度的細菌。許多研究表明，類桿菌、厚壁菌和變形桿菌是反芻動物瘤胃中的3 種優勢菌[29-30]。魏園等[31]對梅花鹿瘤胃微生物的研究發現，在飼喂柞樹(Quercus mongolica)葉時，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的豐度在生物總量的90%以上，而本研究中各組的擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的總豐度在79.91%～89.39%，二者結論相似，陳麗娟等[32]在對不同比例構樹(Broussonetia papyrifera)與苜蓿混合對安格斯母牛瘤胃細菌多樣性的影響研究中也證明，這3 種細菌豐度總量在80% 以上；Kim 等[33]利用16S rRNA 基因測序技術研究發現反芻動物瘤胃菌群中厚壁菌門(57.8%) 和擬桿菌門(26.7%) 在數量上占主導地位。進一步驗證瘤胃微生物群落總體是以這3 種菌群為優勢群落。從屬水平來看，纖維桿菌屬是纖維桿菌門下的唯一菌屬[34]，本研究中，飼喂多年生黑麥草 + 毛苕子混合干草使纖維桿菌的豐度顯著降低，不利于纖維桿菌的生長。普氏菌廣泛參與多種微生物的代謝，具有高活性降解半纖維素和適應不同膳食結構的能力，在蛋白質、淀粉、木聚糖和果膠的降解中起著重要作用[35]。

多年生黑麥草 + 毛苕子組普氏菌屬的相對豐度顯著高于CK 組，說明飼喂多年生黑麥草 + 毛苕子混合干草能在一定程度上增加普氏菌的數量，進而提高半纖維素的分解效率。

此外，根據現有的細菌數據庫，發現了大量未鑒定菌屬，這可能是薩能奶山羊瘤胃內獨特的微生物菌群，在今后的研究中有待于進一步發掘。

4 結論

本研究表明，不同混合干草飼喂薩能奶山羊公羔時，可以提高瘤胃及腸道細菌群落多樣性，改善胃腸道微生物區系，通過增加胃腸道中有益細菌的豐度和減少致病菌的豐度來促進營養代謝，促進健康，其中以紫花苜蓿 + 多年生黑麥草混合干草效果最佳。