檸檬酸添加劑對圓葉決明青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)與發(fā)酵特性的影響

韓雪林，史文嬌，張 娟，張 磊，李蘇濤，馮啟賢，陽伏林

（福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002）

圓葉決明(Chamaecrista rotundifolia)為豆科多年生草本植物，草質(zhì)柔軟，營養(yǎng)價值豐富(與南方廣泛應用的豆科牧草接近)，是一種新發(fā)現(xiàn)的飼、肥兼用的牧草[1-2]。圓葉決明具有較強的抗逆性、適應性和再生性，并且既耐旱又耐高溫、病蟲害少，對環(huán)境條件要求低，在營養(yǎng)匱乏和酸性環(huán)境中生長良好，固氮能力強，適宜在南方進行大面積種植[3-4]。在飼喂草食性動物的過程中發(fā)現(xiàn)圓葉決明對其生長發(fā)育及生理變化等有顯著的促進作用，諸多養(yǎng)殖場已投入生產(chǎn)實踐[1,5-6]。但新鮮的圓葉決明牧草含有堿性物質(zhì)、味甘、單寧含量高、適口性差[7]，且南方多雨，草料儲存易受濕熱環(huán)境影響發(fā)霉變質(zhì)，因此對圓葉決明進行青貯處理不僅能改善飼料適口性，而且能夠延長保存時間。酸度是影響青貯飼料的一個重要因素，適宜的酸度能很好地調(diào)節(jié)青貯飼料的適口性，而酸度過低會有酸澀等現(xiàn)象[8]。檸檬酸(citric acid, CA)是一種應用廣泛的酸化劑和抗氧化劑，比青貯飼料中常用的甲酸和乙酸更安全[9]，可通過微生物發(fā)酵獲得，生產(chǎn)成本低[10]。發(fā)酵過程中，CA 能迅速降低pH，抑制霉菌、酵母菌等不良菌群的繁殖活動，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[11]；同時CA 作為發(fā)酵底物，為乳酸菌提供碳源，促進乳酸菌生長[12]；此外，乳酸菌能將CA 代謝生成具有香味的雙乙酰和乙酸等物質(zhì)[13-14]，可改善青貯飼料適口性。目前，國內(nèi)對圓葉決明的研究還停留在套作、品種選育上，對其青貯技術的研究還未見報道，因此開發(fā)圓葉決明青貯技術，在畜牧生產(chǎn)中的應用具有巨大的意義和價值。

本研究主要通過添加不同水平CA 對圓葉決明進行不同天數(shù)的青貯發(fā)酵，分析比較圓葉決明青貯發(fā)酵前后的營養(yǎng)價值，評定發(fā)酵品質(zhì)，闡明CA 及不同發(fā)酵程度對圓葉決明青貯品質(zhì)的影響，為圓葉決明在飼養(yǎng)生產(chǎn)上更好的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用采自福建省漳州市漳浦縣萬安農(nóng)場的結莢期圓葉決明作為青貯原料，距離地面8～10 cm 處進行刈割。添加劑檸檬酸(AR ≥ 99.0%)阿拉丁，購于福州麥力生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

試驗共分為5 個試驗組和3 個青貯時間處理。5個試驗組分別添加0(CK)、0.1% (Ⅰ)、0.3% (Ⅱ)、0.5% (Ⅲ)、1.0% (Ⅳ)的CA，CA 添加量為占青貯原料鮮重(fresh matter, FM)百分比(25 mL·kg?1)，CK 組加等量蒸餾水。設置青貯時間30、45 和60 d，每個試驗組每個青貯時間處理各3 個重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 青貯樣品的制備

將采集的圓葉決明鮮草樣室溫存放晾曬至24 h，用鍘草刀切成1～2 cm 小段，切碎后混合均勻。按試驗設計將添加劑或蒸餾水(CK)均勻噴灑在每個處理的2 kg 樣品上，充分混勻后，迅速分裝入青貯袋中，每袋約400 g，抽出空氣達到真空狀態(tài)后封口，室溫存放發(fā)酵30、45 和60 d 后測定化學成分及發(fā)酵指標含量。

1.3.2 測定指標與方法

基本營養(yǎng)物質(zhì)指標：青貯30、45 和60 d 后每個處理各隨機抽取3 袋開封，將樣品混合均勻后，取200 g 樣品65 ℃烘箱中烘至恒重，測定干物質(zhì)(dry matter, DM)含量、測定粗蛋白(crude protein, CP)含量參考標準(GB/T 6432-2018)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)含量(GB/T 20806-2006)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量和水溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)含量[15]。

青貯發(fā)酵特性分析：取10 g 代表性樣品放入250 mL 錐形瓶中加入90 mL 蒸餾水，4 ℃冰箱浸提24 h 后，4 層紗布和定性濾紙過濾，一部分濾液用于測定pH[16]，每個樣品重復測定3 次；另一部分通過0.22 μm 的濾篩過濾后分裝，?20 ℃保存，用于測定氨態(tài)氮[17](NH3-N) 、有機酸[乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)和丙酸(propionic acid, PA)]含量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013 整理試驗數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0 進行單因素和雙因素方差分析與多重比較。

2 結果與分析

2.1 圓葉決明鮮草營養(yǎng)成分

圓葉決明鮮樣中DM 含量為25.00%，干樣中的CP 含量為18.08%、NDF 含量為60.49%、ADF 含量為41.18%、WSC 含量為3.50%，鮮樣pH 為6.07。

2.2 不同檸檬酸水平及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的影響

CA 對圓葉決明青貯各營養(yǎng)指標影響顯著(P<0.05)，除DM 外發(fā)酵時間對其他營養(yǎng)指標影響顯著(P< 0.05)。檸檬酸和發(fā)酵時間的交互作用對NDF和ADF 含量影響顯著(P< 0.05)，對其他營養(yǎng)指標影響不顯著(P> 0.05)。青貯30 d 時，圓葉決明有較高的DM 含量，Ⅳ處理組最高，為27.21% (表1)。青貯30、45 和60 d 時，CP 含量均以Ⅳ組最高，分別為16.94%、16.51%和15.64%，顯著高于CK 組(P< 0.05)，但青貯30 d 與45 和60 d 間差異不顯著(P> 0.05)。隨著青貯周期的延長，NDF 和ADF 含量呈先升高后下降趨勢。青貯30、45 和60 d 時，Ⅳ組的NDF和ADF 含量均顯著低于CK 組，其中，NDF 含量分別降低4.64%、5.29% 和2.13%；ADF 含量分別降低2.39%、2.49%和1.72%。青貯60 d 時，各處理NDF 和ADF 含量最低，且均以Ⅳ組最低，分別為54.25%和40.94%；各處理NDF 含量與30 和45 d相比差異顯著(P< 0.05)，CK 組和Ⅰ組的ADF 含量與30 和45 d相比差異顯著(P< 0.05)。CA 對圓葉決明WSC 含量無顯著作用(P> 0.05)，青貯30、45 和60 d 時，均以Ⅳ組的WSC 含量最高，其中，青貯30 d 的Ⅳ組最高，為1.33%。

表1 不同處理及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different treatments and fermentation times on the nutrient composition of Chamaecrista rotundifolia silage

2.3 不同檸檬酸水平及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響

CA 及發(fā)酵時間對圓葉決明各發(fā)酵指標均有影響顯著(P< 0.05)，二者的交互作用對圓葉決明青貯NH3-N/TN 及PA含量影響顯著(P< 0.05)，對pH、LA 和AA 含量無顯著性影響(P> 0.05)。在各青貯周期中，隨著CA 含量的增加各處理圓葉決明青貯pH 均呈下降趨勢。與CK 組相比，其他試驗組pH 顯著降低(P< 0.05)，且pH 均在5.0 以下。各青貯期試驗組NH3-N/TN 均顯著降低(P< 0.05)，且均以Ⅳ組的NH3-N/TN 最低，分別下降了2.89%、3.78%和3.60%。青貯30 d 時NH3-N/TN 顯著低于60 d (P<0.05)，且Ⅳ組的NH3-N/TN 最低，較60 d 時低0.53%。各試驗組LA 含量均顯著高于CK 組(P< 0.05)，但各試驗組間差異不顯著(P> 0.05)。各處理組均以青貯30 d 時LA含量最高。青貯30 和45 d，Ⅲ組的AA 含量顯著低于CK 組和試驗Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組(P<0.05)。青貯60 d 時，Ⅲ和Ⅳ組的AA 含量顯著低于CK 組(P< 0.05)。各試驗組PA 含量均顯著低于CK組(P< 0.05)，青貯30、45 和60 d 時，Ⅲ組的PA 含量均最低(P< 0.05)，但各青貯期PA 含量差異不顯著(P< 0.05) (表2)。

表2 不同處理及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響Table 2 Effects of different treatments and fermentation times on the fermentation characteristics of Chamaecrista rotundifolia silage

3 討論

3.1 檸檬酸及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)的影響

DM 含量不僅決定了青貯飼料中營養(yǎng)物質(zhì)含量，更是青貯發(fā)酵啟動的關鍵因素。青貯過程中，由于植物細胞的呼吸作用及微生物發(fā)酵，會造成青貯原料DM 損失[19]，酸性添加劑能加速飼料酸化，抑制蛋白降解和有害菌的繁殖活動，減少青貯過程中飼料營養(yǎng)物質(zhì)的損失[20]。本研究中，各試驗組DM含量均高于CK 組，當CA 添加量為1.0%時，DM 含量最高，這說明CA 的添加為青貯提供了額外的發(fā)酵底物，同時形成的酸性壞境抑制了有害菌的活性，青貯原料DM的損耗降低。經(jīng)CA處理后能提高WSC濃度，這與張晴晴等[21]在燕麥(Avena fatua)青貯發(fā)酵中添加有機酸后WSC 含量高于CK 組的結果基本一致。青貯期對圓葉決明WSC 的消耗較低可能是因為有機酸CA 本身提供了額外發(fā)酵底物，同時有機酸的添加得到較低的pH，抑制了青貯期不良菌群的繁殖活動[22-23]。各試驗組圓葉決明青貯CP 含量升高，Ke 等[16]在苜蓿青貯中添加不同濃度檸檬酸后蛋白含量增加且隨添加量不斷增加蛋白含量上升，這與本研究結果一致。這說明添加CA 能抑制青貯料蛋白質(zhì)的降解。飼料中纖維含量越高，青貯發(fā)酵越難，青貯料適口性越差。本研究中，CA 處理顯著降低了圓葉決明中的NDF 和ADF 含量。這與Zi 等[24]在王草(Pennisetum purpureum)青貯中添加檸檬酸及隨青貯時間的延長青貯料的NDF 和ADF 含量降低的結果基本一致，這說明CA 有一定的酸化能力，能破壞完整穩(wěn)定的細胞壁結構，降低圓葉決明纖維含量，提高營養(yǎng)價值[25-26]。Ke 等[22]的研究表明0.5% CA 處理對紫花苜蓿(Medicago sativa)NDF 和ADF 含量無顯著影響，而本研究中添加0.5%和1.0%的CA 能夠顯著降低圓葉決明青貯料的NDF 和ADF 含量，這可能是因為本研究所用的豆科牧草圓葉決明纖維含量較高。由此可見，CA 能夠改善圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)，當添加水平為0.5%和1.0%時，青貯營養(yǎng)品質(zhì)改善效果最好，且二者之間差異不顯著。

青貯營養(yǎng)品質(zhì)隨發(fā)酵時間的變化不斷變化。除DM 外，發(fā)酵時間對其他營養(yǎng)指標均影響顯著，隨著發(fā)酵時間延長，各組DM、CP 和WSC 含量均有不同程度的降低，NDF 和ADF 的含量呈現(xiàn)上下浮動，在青貯60 d 時，各組DM、CP 和WSC 含量與原料相比損耗最多，NDF 和ADF 含量最低。其含量變化與盧強等[27]、張放等[28]和王子苑等[29]報道的青貯料營養(yǎng)成分動態(tài)變化規(guī)律一致。這說明較長的發(fā)酵時間需要更多的底物和能量去維持微生物的生長繁殖、促進發(fā)酵的進行，導致青貯料中所殘留的DM、CP 和WSC 含量相對降低；青貯原料存放過程中纖維素的部分降解及低pH 對飼料纖維酸化程度更強，造成NDF 和ADF 含量降低。王致敬等[30]研究表明隨青貯時間延長鳳梨(Ananas comosus)渣青貯CP 含量逐漸增加，與本研究結果不一致，這可能是因為圓葉決明WSC 含量較低，無法滿足微生物發(fā)酵所需能量，在青貯過程中消耗利用了部分蛋白質(zhì)，使CP 含量降低。毛翠等[31]的研究中表明玉米(Zea mays)各組隨青貯時間延長，NDF 含量增加，ADF 含量降低，與本研究結果不一致，這可能是由全株玉米與本研究所用圓葉決明的類型、添加劑種類及發(fā)酵天數(shù)不同造成的。因此，不同發(fā)酵時間對圓葉決明青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響不同，發(fā)酵時間越長消耗的底物越多，但消耗的纖維含量越少。

檸檬酸添加劑與發(fā)酵時間的交互作用對NDF和ADF 含量影響顯著，對其他營養(yǎng)指標影響不顯著，這說明二者的交互作用中檸檬酸是影響圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)的關鍵因素。發(fā)酵時間主要影響纖維成分。

3.2 檸檬酸及發(fā)酵時間對圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響

青貯飼料pH 在發(fā)酵特性評價中起至關重要的作用，低pH 可以抑制不良酵母和霉菌[32]，提升飼料發(fā)酵品質(zhì)。因此，通過添加CA 快速降低pH，抑制不良菌群，提高發(fā)酵品質(zhì)。本研究中，CA 處理組的pH 與CK 組的相比顯著降低，且隨CA 含量增加pH 不斷降低，其值均在5.0 以下，這與Ke 等[16]研究結果一致，說明CA 可促進圓葉決明青貯發(fā)酵，為乳酸菌提供發(fā)酵底物，增強產(chǎn)乳酸能力，導致青貯飼料pH 降低。但Li 等[33]的研究表明CA 的添加導致紫花苜蓿青貯飼料pH 升高，與本研究的結果不一致，這可能是因為本研究所用圓葉決明與紫花苜蓿相比具有較強的酸度和較低的緩沖能力。NH3-N/TN反映了飼料蛋白降解程度，比值越小說明飼料蛋白保存越好。本研究中CA 的添加顯著降低了NH3-N/TN，其中1.0%CA 組NH3-N/TN 最低，這一結果與He 等[34]和Ke 等[16]的研究結果一致，這是因為有機酸的添加降低了pH，抑制了植物蛋白酶的活性和較弱的耐酸細菌及不良微生物發(fā)酵，較大程度地保留了蛋白質(zhì)含量；也可能是因為圓葉決明中的的單寧含量較高，濃縮單寧與蛋白質(zhì)有較高的親和力，在飼料發(fā)酵過程中保護蛋白質(zhì)不被降解[35-36]。乳酸是青貯的主要發(fā)酵產(chǎn)物，是青貯發(fā)酵特性的重要評價指標。CA 的添加降低了青貯環(huán)境pH，抑制有害菌的生長，同時為乳酸菌提供能量，加快乳酸菌的生長，促進發(fā)酵進程[33]。本研究中，CA 顯著提高了圓葉決明青貯料的LA 含量，但不同的添加水平對LA 含量的影響不同，低濃度0.1% 的乳酸含量最高。Ke 等[16]研究表明CA 能顯著提高紫花苜蓿青貯LA 含量，且隨CA 的增加，LA 含量逐漸降低，這與本研究結果基本一致，說明高濃度的CA 形成較強的酸性環(huán)境，抑制了乳酸菌的活性，削弱了乳酸菌產(chǎn)乳酸的能力，進而LA 含量降低。青貯后AA 和PA 含量降低，當CA 水平為0.5%時AA 和PA 含量最低(P< 0.05)，Li 等[37]的研究表明當CA 添加量為0.5% 時木薯(Manihot esculenta)的AA 含量基本不變，PA 含量顯著低于對照組。這可能是因為本研究所用的圓葉決明與木薯葉營養(yǎng)成分不同，CA 對其的作用也有差異，同時CA 可以直接酸化飼料，快速形成酸性環(huán)境，抑制乳酸菌對乳酸和檸檬酸的作用，降低了乙酸含量[38-39]。由此可見，青貯中添加CA 能提高圓葉決明發(fā)酵品質(zhì)，當CA 添加量為0.5%時效果最佳。

青貯30、45 和60 d 時CK 組的pH 無顯著變化，且高于5.0，這說明圓葉決明很難直接青貯，發(fā)酵天數(shù)對其單獨青貯無顯著性影響。隨發(fā)酵時間延長，能觀察到隨CA 含量的增加不同發(fā)酵時間段對青貯料pH 的影響降低，說明CA 水平與發(fā)酵天數(shù)的交互作對pH 的影響不顯著。圓葉決明青貯NH3-N/TN隨青貯周期延長不斷升高，這在賈戌禹等[40]的研究中得到相似的結果。隨著CA 添加量的增加NH3-N/TN 隨青貯周期延長升高的比例越來越小，這說明微生物發(fā)酵隨青貯期延長，消耗更多的底物，蛋白質(zhì)降解相對增多，但CA 水平與發(fā)酵天數(shù)的交互作用減少了NH3-N 的產(chǎn)生，有效保留了青貯料CP 含量。青貯過程中LA 含量呈下降趨勢，在青貯45 和60 d 后LA 含量降低且差異不顯著，可能是因為青貯30 d 時乳酸的大量積累，抑制了后期乳酸菌的活性，減少了乳酸的產(chǎn)生[41]。但Lyu 等[42]報道隨青貯時間延長陽春砂(Fructus Amomi)青貯料中LA 含量逐漸升高，與本研究結果不一致，這可能是本研究所用的圓葉決明為豆科牧草，陽春砂為姜科植物，兩種研究用草類型及青貯時長不一樣所致。青貯料AA 含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加有波動，但整體呈現(xiàn)下降趨勢，這與鄒詩雨等[43]和劉桂要[44]的研究結果不一致，可能是因為在青貯60 d 時，青貯料的pH 過低，抑制了醋酸菌的活動，減少了AA 的產(chǎn)生。PA 具有抑菌作用，在青貯原料中含量較低[45]。在青貯30 和45 d 時PA 含量呈下降趨勢，但在青貯60 d 時，PA 含量顯著升高，與陳鑫珠等[46]在不同發(fā)酵時間對菌糠發(fā)酵品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵60 d 后PA 含量顯著升高的結果一致。總體來看，不同發(fā)酵時間對圓葉決明發(fā)酵特性的影響不一，青貯時間短，發(fā)酵特性較好。

本研究中，檸檬酸與發(fā)酵時間的交互作用對圓葉決明pH、LA 和AA 無顯著影響，但檸檬酸是影響青貯pH、LA 和AA 含量的主要因素，青貯時間對NH3-N/TN 和PA 的影響顯著。

4 結論

添加CA 后能夠有效改善圓葉決明青貯品質(zhì)，在CA 添加量為0.5%和1.0%時圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)效果最好，CA 添加量為0.5%時圓葉決明發(fā)酵特性效果最佳；檸檬酸與發(fā)酵時間的交互作用顯著影響了NDF、ADF、NH3-N/TN 和PA 含量，對其他指標無顯著影響。綜合經(jīng)濟、安全、環(huán)保等因素，在圓葉決明青貯時，當CA 添加量為0.5%、青貯時間為30 d 時，其青貯品質(zhì)效果最佳。