不同作用機制殺菌劑對燕麥炭疽病病菌的室內毒力測定

高 鵬，劉 琳，劉昀鑫，魏江銘，李 瑤，趙 祥

（山西農業大學草業學院，山西 太谷 030801）

燕麥(Avena sativa)是世界范圍內廣泛種植的糧飼兼用植物。隨著我國推動糧經飼統籌和草牧業的快速發展，燕麥種植面積逐年擴大，但病害問題成為限制其生產的瓶頸[1]。山西晉北地區是我國飼用燕麥的主產區之一，2018 – 2020年，本研究通過對該地區燕麥病害調查發現，由禾谷炭疽菌(Colletotrichum cereale)引致的炭疽病呈現持續暴發流行的特點，病田率和病株率高達100%，導致大量葉片枯黃，嚴重時引起植株早衰，造成嚴重減產[2-3]。

炭疽菌屬(Colletotrichum) 亦稱刺盤孢屬，為半知菌類真菌，其無性態可產生大量直或彎曲的分生孢子。目前已發現部分種的有性態為子囊菌門(Ascomycota)小叢殼科(Glomerellaceae) 小叢殼屬(Glomerella)真菌[4]。禾谷炭疽菌的分生孢子呈鐮刀形，次生分生孢子部分變直，其有性態尚不清楚。在大于90%的空氣濕度或水滴中，分生孢子可萌發產生黑褐色、卵圓形或近圓形的附著胞[2]，然后發展形成侵染釘侵入寄主角質層或皮層，通過初生菌絲和次生菌絲在寄主葉肉細胞內擴展，同時分泌細胞壁降解酶，殺死寄主細胞獲取營養，最后在葉表產生分生孢子盤和分生孢子，借助風雨進行侵染循環[5-6]。

禾谷炭疽菌引致的炭疽病是燕麥的主要病害之一，除山西省，在美國、巴西和加拿大以及中國的內蒙古自治區和甘肅省等燕麥主產區均有報道[1,7]。傳統控制植物病害的方法包括抗病品種選育、生物防治、改善農業措施和化學防治等。不同防治方法各有利弊，化學防治具有見效快、防效顯著、操作簡便和成本較低等特點，但也容易使病原菌產生抗藥性，對環境和食品安全造成一定危害[8]。因此，掌握殺菌劑的安全用藥方法，科學、合理地選擇多種作用機制的殺菌劑，是有效防治病害的關鍵[9]。

19 世紀七八十年代，銅制劑和硫磺等無機和金屬類殺菌劑問世以來，取代苯類、二硫代氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、三唑類、甲氧基丙烯酸酯類和酰胺類等不同作用機制的有機殺菌劑相繼創制[10]，在防控作物病害、提高全球作物產量、改善人類食品安全和健康狀況等方面發揮重要作用[8]。但目前尚未見對燕麥產區炭疽病采取防治措施，和關于化學殺菌劑防治燕麥炭疽病的相關報道。鑒于此，本研究通過前期試驗初步分析了7 大類12 種殺菌劑對禾谷炭疽菌的抑菌效果，發現除腐霉利和異菌脲等酰胺類殺菌劑外，其余6 大類10 種殺菌劑均有顯著防效，本研究將進一步對其抑制菌落生長和孢子萌發的效果進行測定，以期篩選出不同作用機制的高效低毒殺菌劑，為燕麥炭疽病的田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試培養基和菌種：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA) 培養基，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉17 g，蒸餾水定容到1 L。禾谷炭疽菌菌種分離自山西省大同市天鎮縣的燕麥炭疽病病株，使用單孢分離法純化后于4 ℃冰箱中保存，菌落及分生孢子萌發特征如圖1 所示。在PDA 培養基上活化30 皿并置于23 ℃培養箱中黑暗培養7 d，用于接種和制備孢子懸浮液。

圖1 燕麥炭疽病菌菌落(a)、分生孢子(b)、芽管(c)、附著胞(d)和菌絲(e)Figure 1 The colony (a), conidium (b), germ tube (c), appressorium (d), and hypha (e) of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

供試殺菌劑：供試的10 種殺菌劑均為農資市場購買，殺菌劑類型根據殺菌劑抗性行動委員會(FRAC) 2010年分類目認定[11]，各殺菌劑的劑型、類型、生產廠家如表1 所列。

表1 供試殺菌劑的基本信息Table 1 Information on the fungicides used in this study

分別采用菌絲生長速率法和液滴法，在預試驗的基礎上，確定各殺菌劑抑制菌絲生長和孢子萌發的供試濃度，每種殺菌劑設置5 個梯度供試濃度(表2)。

表2 供試殺菌劑抑制菌絲生長和孢子萌發的梯度供試濃度Table 2 Fungicide concentrations for sensitivity assays with mycelial growth and spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

1.2 試驗方法

1.2.1 含藥培養基的制備

在超凈工作臺中，使用微量電子天平或移液器稱量對應質量或體積的殺菌劑放入滅菌錐形瓶中，使用滅菌量筒量取無菌水，將各殺菌劑配制成最大供試濃度的10 倍液，然后將10 倍液依次按1/2 倍稀釋，獲得供試濃度的10 倍液。充分搖晃錐形瓶，使藥劑混勻。使用滅菌移液器分別量取1 mL 供試濃度的10 倍液加入9 mL 約50 ℃的PDA 培養基中充分混勻。每個濃度設4 個重復，以等量無菌水處理作為對照。

1.2.2 接種和菌落測量

用直徑為5 mm 的打孔器在培養7 d 的禾谷炭疽菌菌落邊緣打孔，菌絲一面向下放置在制備好的含藥培養基中央，每皿接種一個菌餅，置于23 ℃恒溫黑暗培養箱中培養。培養至第6 天時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率 = [(對照菌落直徑 ? 處理菌落直徑) / (對照菌落直徑 ? 菌餅直徑)] × 100%。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

選擇培養7 d 的禾谷炭疽菌菌落，用滅菌毛筆將培養基表面的菌絲輕輕刮下，無菌水沖洗3 次，5 層無菌紗布過濾，用血球計數器將孢子濃度調至1 × 105個·mL?1。

1.2.4 孢子萌發的測量

將長 × 寬 × 高為7.5 cm × 2.5 cm × 0.5 cm、中央凹孔直徑1.6 cm、深度0.2 cm 的滅菌單凹載玻片放入底部平鋪2 張滅菌濾紙，并放入用5 mL 無菌水浸透的培養皿中。使用滅菌移液器吸取0.09 mL 孢子懸浮液和0.01 mL 供試濃度的10 倍液，置于單凹載玻片凹槽中充分混勻，將培養皿封口并置于23 ℃培養箱中黑暗培養。在培養12 h 時，在顯微鏡下觀察分生孢子的萌發情況。隨機觀察100 個孢子，統計萌發的孢子總數，當芽管或菌絲長度超過孢子直徑的1/2，或產生附著胞時視為萌發(圖1)。計算孢子萌發率和孢子萌發抑制率。每個濃度設4 個重復，以等量無菌水處理作為對照。

孢子萌發率 = (萌發的孢子數 / 孢子總數) × 100%；

孢子萌發抑制率 = [(對照孢子萌發率 ? 處理孢子萌發率) / 對照孢子萌發率] × 100%；

1.3 統計分析

采用SPSS 23.0 進行數據統計分析。將抑制率轉換為機率值，以各殺菌劑供試濃度的對數為自變量，對應的抑制率機率值為因變量，進行線性回歸，獲得毒力回歸方程并計算有效中濃度(EC50)。使用每種殺菌劑的毒力回歸方程計算抑制率實測值對應的預測值，并進行χ2檢驗，獲得相關參數，評估實測值和預測值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

6 大類10 種殺菌劑對燕麥炭疽病菌菌絲生長均有一定抑制作用，通過對毒力回歸方程進行擬合，經χ2檢驗，發現抑制率的預測值和實測值之間差異顯著(P> 0.05)，因此對EC50的估測值具有統計學意義。其中，50%多菌靈可濕性粉劑、25%丙環唑乳油、25%嘧菌酯懸浮劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑對禾谷炭疽菌菌絲生長的抑制作用最強，EC50分別為0.092 1、0.877 4、0.118 0 和0.002 9 mg·L?1；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑的抑制作用次之，EC50分別為1.755 1、2.576 9和1.537 1 mg·L?1；80%代森錳鋅可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑和25%溴菌晴可濕性粉劑的抑制作用較弱，EC50分別為10.690 5、4.753 4和5.628 6 mg·L?1(表3)。

表3 不同類型殺菌劑對燕麥炭疽病病菌菌絲生長的毒力測定Table 3 Indoor toxicity tests of various fungicides against mycelial growth of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

當75%百菌清可濕性粉劑濃度大于0.800 0 mg·L?1時，孢子萌發抑制率均為100%；小于0.800 0 mg·L?1時，對孢子萌發無顯著抑制作用。43% 戊唑醇懸浮劑和25% 丙環唑乳油對孢子萌發均無顯著抑制作用。對其余7 種殺菌劑的毒力回歸方程進行擬合，經χ2檢驗，所得抑菌率的預測值和實測值之間差異顯著(P> 0.05)，因此對EC50的估測值具有統計學意義。其中，50%多菌靈可濕性粉劑、25%嘧菌酯懸浮劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑對禾谷炭疽菌孢子萌發的抑制作用最強，EC50分別為0.112 4、0.118 4 和0.005 9 mg·L?1；80%代森錳鋅可濕性粉劑和50%福美雙可濕性粉劑的抑制作用次之，EC50分別為0.755 3和0.792 9 mg·L?1；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和25%溴菌晴可濕性粉劑的抑制作用較弱，EC50分別為3.188 6 和2.185 8 mg·L?1(表4)。

表4 不同類型殺菌劑對燕麥炭疽病病菌孢子萌發的毒力測定Table 4 Indoor toxicity tests of various fungicides against spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

3 討論

百菌清通過抑制病原菌胞內三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate)的活性，導致谷胱甘肽(glutathione) 及下游蛋白的合成受阻[12]。代森錳鋅和福美雙則對含有巰基(-SH)或含有金屬的酶活性具有抑制作用[13]。這3 種殺菌劑均具有多位點接觸活性且產生耐藥性風險較低等優點，是作物和經濟植物病害防治中普遍使用的保護性殺菌劑[14]。本研究結果表明，百菌清、代森錳鋅和福美雙均對燕麥炭疽病菌菌絲生長有顯著抑制作用，其中百菌清的EC50最低，為2.576 9 mg·L?1，且遠低于對膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)的EC50(173.341 0、151.441 0 mg·L?1)[15]。但作為保護性殺菌劑，更需要關注對孢子萌發的抑制效果[13]。本研究未得到百菌清濃度和孢子萌發抑制率的回歸方程，但發現當有效濃度≥ 0.800 0 mg·L?1時，對孢子萌發的抑制率達100%。代森錳鋅和福美雙抑制孢子萌發的EC50相近，分別為0.755 3 和0.792 9 mg·L?1?？梢姡谙嗤佬?，百菌清用藥量更低。因此在燕麥炭疽病發生前，百菌清可作為防治燕麥炭疽病的保護性殺菌劑。

多菌靈和甲基硫菌靈是以苯丙咪唑環為母體的一類有機殺菌劑，通過與真菌菌絲和孢子芽管中的β 微管蛋白(β-tubulin protein)結合抑制病菌有絲分裂[16]，兼具內吸治療和保護作用，是較早用于防治植物炭疽病的殺菌劑之一。多菌靈抑制燕麥炭疽病菌菌絲生長的EC50為0.092 1 mg·L?1，低于對禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、亞麻刺盤孢(Colletotrichum linicola)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的EC50(0.9569、0.510 9 和0.1740 mg·L?1)[15,17-18]，也低于聯合國糧食及農業組織允許的最高限量(0.100 0 mg·L?1)[19]，表明該病原尚未對多菌靈產生抗性。此外，多菌靈對孢子萌發也有顯著抑制效果，但孢子對其敏感性較菌絲要低，因此噴施濃度要與孢子抑制濃度相一致，才能同時發揮內吸治療和保護作用。甲基硫菌靈對燕麥炭疽病菌也具有顯著防效，但其EC50明顯要高，因此多菌靈更適合用于防治燕麥炭疽病。

戊唑醇和丙環唑為甾醇脫甲基作用抑制劑(sterol demethylation inhibitors，DMIs)，通過干擾或阻斷病原菌麥角甾醇生物合成發揮抗菌作用，是目前應用最為廣泛的內吸性殺菌劑，對子囊菌和擔子菌等真菌引起的多種病害具有顯著防效[20]。DMIs 也是目前唯一報道用于防治禾谷炭疽菌(C.cereale)引致多種禾草炭疽病的一類殺菌劑。在美國加州，通過分析禾谷炭疽菌對DMIs 的敏感性，發現戊唑醇和丙環唑抑制菌絲生長的EC50均值分別為0.082 0和0.140 0 mg·L?1[21]，是本研究結果的18.7 和6.2 倍。而該研究同時分析了長期使用DMIs 對禾谷炭疽菌產生抗藥性的影響，結果表明，EC50值顯著提高了6.5 倍[21]。由此可見，晉北地區燕麥炭疽病菌可能對DMIs 產生了一定的抗藥性，在病害防治中應慎重使用。

嘧菌酯和吡唑醚菌酯是近年來創制的一類新型的醌外抑制劑(quinone outside inhibitors，QoIs)，其殺菌作用與真菌細胞色素(cytochrome b，Cytb)BC1 酶復合物Qo 位點的結合密切相關，可抑制線粒體的呼吸及能量釋放[22]。孢子萌發是一種高度依賴能量的生理過程，因此大多數分生孢子的線粒體被分配到芽管里[15]，這可能是燕麥炭疽病菌孢子對嘧菌酯和吡唑醚菌酯高度敏感的原因。所有供試殺菌劑中，吡唑醚菌酯是抑制菌絲生長和孢子萌發最有效的殺菌劑，兼具保護和治療作用，且與已報道對膠孢炭疽菌和平頭炭疽菌(Colletotrichum truncatum)的EC50相近[14,23]，尚未產生抗性，因此在燕麥炭疽病的防治中優先使用。

本研究供試的燕麥炭疽菌種分離自晉北地區大同市天鎮縣的燕麥種植田，對該地區其他市(縣)燕麥病害調查發現炭疽病均有發生，但上述地區均未采用噴施殺菌劑防治病害，這可能是導致病菌對供試的大多數殺菌劑尚未產生明顯抗性的原因。此外，室內測定結果與田間實際使用防效可能存在差異，有待進一步通過田間試驗驗證殺菌劑的實際防效。隨著該地區燕麥生產規模擴大和種植年限的增加，病害防控形式將愈發嚴重，建議生產者高度重視炭疽病的流調工作，及時輪換采用不同作用機制的化學殺菌劑防控病害，同時改善種植條件，引進和選育抗病品種，保證燕麥的可持續生產。

4 結論

本研究通過對6 大類10 種殺菌劑抑制菌落生長和孢子萌發效果的測定，證實對燕麥炭疽病菌均具有顯著防效，但不同殺菌劑和濃度之間以及對菌絲生長和孢子萌發的抑制效果存在差異。其中多菌靈、丙環唑、嘧菌酯和吡唑醚菌酯對禾谷炭疽菌菌絲生長的抑制作用較強；百菌清、多菌靈、嘧菌酯和吡唑醚菌酯對禾谷炭疽菌孢子萌發的抑制作用較強。根據作用機制的不同，建議百菌清在炭疽病發生前優先作為保護性殺菌劑使用，多菌靈、嘧菌酯和吡唑醚菌酯作為保護和治療性殺菌劑使用。