紫花苜蓿花朵中花色苷的提取及其微膠囊化

鐘迪穎，武治興，劉 陽，楊曉月，張有林

（1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.榆林市科技發展服務中心，陜西 榆林 719000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生優質豆科飼草作物，原產于亞洲，如今廣泛種植于世界各地，種植面積居世界第一，具有產量高、品質好和適用性廣等優良特性，被譽為“牧草之王”[1-4]，在中國西部、中部和華北地區大面積種植[5]，資源豐富。紫花苜蓿花朵中富含花色苷。花色苷是花青素和糖以糖苷鍵連接而成的化合物[6]，主要存在于植物的果實、花朵、莖和葉等部位[7]，可賦予植物紅色、紫色和藍色等絢麗的顏色[8]，是一種天然的水溶性色素[9]。近年來，國內外學者對花色苷進行了廣泛研究，發現其具有抗氧化和抗炎等保健功能[10-11]，但關于紫花苜蓿花朵中花色苷的研究甚少[12]。據報道溫度和光照等條件影響花色苷穩定性[13-14]，造成花色苷應用的局限性[15]。微膠囊化是一種將活性成分包埋在特定壁材中的技術[16]，可以提高活性物質的穩定性，延長物質的保存期[17]，隨著科學水平的進步，目前微膠囊化技術已成為21 世紀的重點高新技術之一，被廣泛應用于食品、藥品和化妝品等多個領域[18]。為此，采用超聲輔助乙醇提取法對紫花苜蓿花朵中的花色苷進行提取，通過響應面法優化提取工藝對花色苷進行微膠囊化處理，以提高紫花苜蓿花朵中花色苷的穩定性和貯藏性，為提高紫花苜蓿利用率和開發新型食品著色劑提供技術方法。

1 材料與方法

1.1 紫花苜蓿花朵中花色苷提取

采摘新鮮紫花苜蓿花，去梗，于?60 ℃下真空冷凍干燥32 h，粉碎過0.425 mm 篩，制得紫花苜蓿花粉末，置于?18 ℃下保存備用。

準確稱取紫花苜蓿花粉末，按一定液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間，在超聲功率為250 W條件下進行超聲輔助提取，用濃度為0.1%的鹽酸調節pH 至1.5，提取液冷卻后在4 ℃低溫8 000 r·min?1高速離心10 min 后取上清液，真空抽濾后得紫花苜蓿花朵中花色苷粗提物，35 ℃旋轉蒸發至膏狀，預凍24 h 后于?60 ℃條件下真空冷凍干燥得紫花苜蓿花色苷。

1.2 花色苷含量的測量方法

參照Urszula 等[19]和宋德群等[20]的方法，以花色苷粗提物為樣品計算花粉末中花色苷的含量，分別 取1.0 mL 樣品加入9.0 mL 的0.025 mol·L?1的氯化鉀緩沖液(pH 1.0)和0.4 mol·L?1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)，振蕩搖勻，室溫條件下避光放置30 min，以蒸餾水為空白對照，在520 和700 nm 波長下測定吸光度。

式中：A=A1?A2(A1和A2分別為pH 1.0 和4.5 時，樣品在520 與700 nm 處的吸光度的差值)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子量(449.2 g·mol?1)；D為樣品的稀釋倍數；V為提取液總體積(mL)；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的消光系數26 900 L·(cm·mg)?1；m為紫花苜蓿花粉末質量(g)；L為光程(cm)。

1.3 花色苷提取單因素試驗

液料比：準確稱量100 mg 紫花苜蓿花粉末，以提取劑為60% (V : V)乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時間為30 min，分別研究液料比為20、25、30、35 和40 mL·g?1對花色苷提取的影響。

乙醇濃度：準確稱量100 mg 紫花苜蓿花粉末，液料比20 mL·g?1，提取溫度60 ℃，提取時間30 min，分別研究乙醇濃度為40%、50%、60%、70% 和80%對花色苷提取的影響。

提取溫度：準確稱量100 mg 紫花苜蓿花粉末，液料比20 mL·g?1，乙醇濃度60%，提取時間30 min，分別研究提取溫度為55、60、65、70 和75 ℃對花色苷提取的影響。

提取時間：準確稱量100 mg 紫花苜蓿花粉末，液料比20 mL·g?1，乙醇濃度60%，提取溫度60 ℃，分別研究提取時間為15、20、25、30 和35 min 對花色苷提取的影響。

花色苷響應面法優化試驗設計：利用Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，以乙醇為提取劑，在上述單因素試驗的基礎上，選擇液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間進行4 因素3 水平響應面優化試驗設計(表1)。

表1 響應面優化試驗設計因素與水平表Table 1 Response surface optimization design factors and levels

1.4 紫花苜蓿花色苷微膠囊化試驗

微膠囊的制備：參照Cai 等[21]的方法。1) 壁材制備。第1 組：麥芽糊精(M)與黃原膠(H)按10 ? 1、20 ? 1 和30 ? 1 (w : w)進行配比；第2 組：麥芽糊精(M)與阿拉伯膠(A) 按10 ?1、20 ? 1 和30 ?1(w:w)進行配比，用蒸餾水制成膠體溶液，固體含量為5%(w : w)，在4 ℃充分水合24 h。2) 花色苷制備。將紫花苜蓿花粉末按1.3 中得到紫花苜蓿花朵中花色苷最佳提取工藝條件進行超聲波輔助乙醇提取，得到花色苷粗提液，低溫旋轉蒸發至膏狀，預凍24 h 后于?60 ℃條件下真空冷凍干燥，得紫花苜蓿花色苷。3) 微膠囊制備。準確稱取100 mg 紫花苜蓿花色苷，室溫下溶于2.0 mL 蒸餾水中，加入8.0 mL 充分水合的壁材膠體溶液，在旋渦混合器3 000 r·min?1條件下充分混合5 min，之后轉至培養皿預凍后冷凍干燥。制備的花色苷微膠囊分別命名為M/A(10/1)-ANS、M/A(20/1)-ANS 、M/A(30/1)-ANS、M/H(10/1)-ANS、M/H(20/1)-ANS 和M/H(30/1)-ANS。空白微膠囊作對照，為M-ANS。

微膠囊包埋率測定：參照Sahar 等[22]的方法。1) 總花色苷含量(TAC)測定：準確稱量100 mg 包埋樣品，加入1.0 mL 蒸餾水，在旋渦混合器中充分混合1 min，放入超聲清洗機內水浴20 min，加入10.0 mL乙醇，提取5 min 后過濾。2) 表面花色苷含量(SAC)測定：準確稱量100 mg 包埋樣品，與10.0 mL 乙醇混合，在旋渦混合器中混合10 s，在3 000 r·min?1離心3 min 后取上清液。

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：參考Amr 等[23]的方法。將樣品均勻平鋪于金屬載物臺，噴金處理60 s，共3 次，用環境掃描電子顯微鏡觀察并拍攝微觀結構。

色差測定：用色差儀測量樣品的亮度(L)、紅綠度(a*)和黃藍度(b*)，根據公式計算其色度(c)和色相角(h°)[21]。

熱穩定性測定：在50 mL·min?1的氮吹掃流下，以10 ℃·min?1的溫度上升速率在30～300 °C 范圍內掃描約5 mg 樣品。

X-射線衍射分析：參照Zhou 等[24]的方法。通過X-射線衍射儀對樣品進行X-射線衍射(XRD)成像。以0.4 λ·min?1的掃描速度測試樣品，記錄2θ 在5°～70°的衍射圖像。

貯藏特性：將包埋的微膠囊樣品分別置于37 和5 ℃的恒溫培養箱，每隔14 d 取樣，測定花色苷含量。

1.5 數據處理

單因素試驗數據采用OriginPro 軟件處理，響應面試驗數據采用Design Expert 軟件處理，SPSS 軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

花色苷含量隨液料比的增加呈先上升后趨于穩定的趨勢，在液料比為30 mL·g?1時達到最大，可能是在適當的液料比條件下，提取劑用量的增加使花色苷與提取劑接觸面積增大[25]，促進花色苷的溶出，而當提取劑用量增加過多，花色苷溶出量已達最大值，同時導致糖類和脂類物質溶出[26]，液料比以30 mL·g?1為宜。花色苷含量隨乙醇濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在乙醇濃度為60%時達到最大。可能是在低濃度條件下，乙醇濃度的增加使環境的滲透壓增大，從而促進花色苷的滲出，而當乙醇濃度過高時，導致溶液的極性過低，不利于花色苷的溶出[27]，乙醇濃度以60%為宜。花色苷含量隨提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，在提取溫度為65 ℃時達到最大，可能是在適當的溫度條件下，細胞內的花色苷易溶出，溫度過高時，破壞了花色苷的結構，導致花色苷的提取量降低，提取溫度以65 ℃為宜。花色苷含量隨提取時間的增加呈先上升后下降的趨勢，在提取時間為25 min 達到最大，可能是在適當的提取時間內，提取時間的增加使溶出的花色苷積累更多，提取時間過長時，部分花色苷被氧化、降解，從而導致花色苷的提取量降低，提取時間以25 min 為宜(圖1)。

圖1 不同液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間對紫花苜蓿花粉末花色苷提取效果的影響Figure 1 Effects of different liquid-to-material ratios, concentration of ethanol, and extraction temperature and time on extracting anthocyanins from alfalfa flower powder

2.2 響應面優化試驗設計及結果分析

在單因素試驗的基礎上進行BBD 響應面優化試驗設計(表2)。回歸擬合后得到花色苷含量(Y)的二次多項回歸模型Y=1.58 + 6.083 × 10?3A+7.833 × 10?3B+ 4.667 × 10?3C+ 1.917 × 10?3D+ 0.030AB?3× 10?3AC? 0.013AD+ 3.5× 10?3BC? 0.018BD+0.011CD? 0.023A2? 0.007 7B2? 0.057C2? 0.015D2。

表2 BBD 響應面優化試驗設計與結果Table 2 BBD response surface optimization design parameters and results

該回歸模型P< 0.001，模型極顯著，失擬項不顯著。R2= 0.990 3，RAdj2= 0.980 5，說明該回歸模型與試驗數據擬合較好，可用于紫花苜蓿花粉末花色苷含量的分析。該模型Y中A、B、AB、AD、BD、CD、A2、B2、C2和D2對結果影響極顯著，C對結果影響顯著(表3)。

各響應面曲線走勢越陡，說明液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間的交互作用對提取花色苷影響越顯著[28]。可以看出，影響作用表現為乙醇濃度 > 液料比 > 提取溫度 > 提取時間(表3、圖2)。

圖2 各因素交互作用的響應面分析圖Figure 2 Response surface evaluations of the interactions among these factors

表3 紫花苜蓿花粉末中花色提取量方差分析Table 3 Analysis of the extraction values for anthocyanins from alfalfa petal powder

2.3 最佳提取條件優化

紫花苜蓿花粉末中花色苷最佳提取工藝條件為液料比31.11 mL·g?1、乙醇濃度60.53%、提取溫度65.15 ℃、提取時間24.56 min。考慮到實際操作的可行性，將以上工藝條件調整為液料比31 mL·g?1、乙醇濃度61%、提取溫度65 ℃、提取時間25 min。在此條件下又進行了3 組平行試驗，得出紫花苜蓿花粉末中花色苷含量為1.581 mg·g?1，該實際值與理論值接近且穩定，獲得的最佳工藝條件可靠。

2.4 紫花苜蓿花色苷微膠囊化

2.4.1 紫花苜蓿花色苷微膠囊包埋率與色差分析

加入水膠體的微膠囊包埋率均高于空白對照，原因是加入水膠體改變了淀粉特性，增大了壁材粘度，使之帶來更好的封裝效率與致密性，但粘度達到一定程度再增加粘度對包埋影響不大。與單一材料相比復合材料更能提高微膠囊的穩定性，包埋效果最好的是M/H(30/1)-ANS，包埋率達到98.37% (表4)。

表4 不同壁材的花色苷微膠囊包埋率及色差分析Table 4 Analysis of encapsulation efficiency and color differences in anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

加入水膠體的花色苷微膠囊亮度均高于空白對照。不同壁材的紫花苜蓿花色苷微膠囊均為紅色。

2.4.2 紫花苜蓿花色苷微膠囊SEM 圖像分析

不同壁材的紫花苜蓿花色苷微膠囊均呈多孔狀結構，這是冷凍干燥過程中水分升華引起的收縮力不均勻造成的(圖3)。從微膠囊的表面形態來看，M/H(30/1)-ANS 和M/A(30/1)-ANS 的表面較M-ANS光滑，進一步證實了水膠體的加入可提高微膠囊的封裝效率[29]。

圖3 紫花苜蓿花色苷不同壁材微膠囊微觀形態Figure 3 Morphology of various alfalfa anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

2.4.3 紫花苜蓿花色苷微膠囊熱穩定性及X-射線衍射分析

采用熱重分析儀對幾種不同壁材的微膠囊進行熱重測定。麥芽糊精與黃原膠和阿拉伯膠相互作用影響了紫花苜蓿花色苷微膠囊的熱穩定性。包埋的微膠囊受熱后重量損失較小，熱穩定性較好(圖4)。花色苷的最大失重發生在115 ℃，這可能是由于花色苷的脫糖反應與開環反應使其降解成了酚酸和醛[30]。含有花色苷的微膠囊的最大失重在225 ℃，這可能是花色苷中糖環發生了脫水反應及CO2流失所致[31]。

一般晶體材料的衍射圖呈尖峰，非晶體材料的衍射圖呈寬峰[32]。M-ANS、M/A-ANS 和M/H-ANS的微膠囊衍射峰都呈寬峰狀，且衍射圖基本相同，表明結晶度較低，均為非晶結構(圖4)。微膠囊的結晶度與流動性和吸濕性有關，結晶度越高則吸濕性越差，Diego 等[33]研究表明，非晶體結構材料的吸濕性要強于晶體材料。本研究表明，紫花苜蓿花色苷微膠囊后吸濕性提高。

圖4 不同壁材微膠囊熱重變化及X-射線衍射圖Figure 4 Thermogravimetry and X-ray diffraction of microcapsules produced using different wall materials

2.4.4 紫花苜蓿花色苷微膠囊貯藏特性

所有花色苷微膠囊在 5 ℃的穩定性均比37 ℃的穩定性高，添加了黃原膠與阿拉伯膠的微膠囊比未添加水膠體的空白微膠囊穩定性更好，水膠體的添加比例對微膠囊的貯藏效果無影響。在5 和37 ℃條件下，紫花苜蓿花色苷經微膠囊化后的貯藏穩定性均優于未經微膠囊化的花色苷。綜合分析，貯藏效果最好的是M/H(30/1)-ANS，其在5 ℃下貯藏28 d花色苷保留率達97.67% (圖5)。

圖5 紫花苜蓿花色苷不同壁材微膠囊的貯藏特性Figure 5 Storage characteristics of Medicago sativa anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

3 討論與結論

紫花苜蓿富含各種生物活性物質，花色苷的提取工藝研究已有文獻報道。許英一等[12]用正交試驗法研究了紫花苜蓿花色苷的提取工藝，在料液比為30 g·mL?1，提取溫度為60 ℃，超聲時間為10 min，提取的總花色苷含量為93.23 mg·(100 g)?1。但上述工藝的提取量低于本研究的1.581 mg·g?1，可見該工藝具有一定的推廣應用價值。Box-Behnken 試驗法相較于正交試驗法，不僅能得到各因素與響應值的明確的函數關系式，而且能全面反映各因素之間的交互作用，確定各因素對響應值的影響順序[34]。本研究中影響紫花苜蓿花朵中花色苷提取含量的因素表現為乙醇濃度 > 液料比 > 提取溫度 > 提取時間。

微膠囊化是一種將活性物質包埋嵌入包埋材料中，形成具有致密物理屏障的微小顆粒的技術，其中被包埋的活性物質稱為芯材，包埋在外部的包埋材料稱為壁材。麥芽糊精是一種易溶解的淀粉水解物，粘度低，可以保持花色苷分子的穩定性，因而被廣泛用作包埋材料。根據水解程度的不同可得到不同分子量的麥芽糊精，其中，葡萄糖當量(DE)在10～20 的麥芽糊精最常用于花色苷的包埋[16,35]。目前，麥芽糊精、阿拉伯膠等水溶性小分子化合物已成功地用作包埋花青素提取物的壁材[36-37]，且大量研究證明，麥芽糊精與水膠體組合可以提高微膠囊的包埋效率[22,38-39]。黃原膠具有耐高溫、耐酸堿、性能穩定等優點，是一種良好的包裝材料。阿拉伯膠具有良好的成膜性和乳化性，可以保護花色苷不被氧化。Ewelina 等[40]以麥芽糊精和阿拉伯膠等水膠體為包埋壁材，對野櫻桃中的花色苷進行微膠囊化，結果表明采用復合包埋壁材的花色苷微膠囊包埋效果好，微膠囊化是保持花色苷等敏感化合物穩定性的有效方法。Cai 等[21]以不同配比的羧甲基淀粉和黃原膠為包埋壁材，對藍莓花色苷進行微膠囊化，結果表明藍莓花色苷微膠囊均具有較高的包埋率，且微膠囊化后的藍莓花色苷穩定性提高。Kanha等[41]采用噴霧 + 冷凍干燥復合方式，以兩種不同的親水膠體(明膠-阿拉伯膠和殼聚糖-羧甲基纖維素)為壁材制備黑米花色苷提取物的微膠囊，結果表明：采用明膠-阿拉伯膠和殼聚糖-羧甲基纖維素制備的微膠囊包埋率分別為84.9% 和94.7%，且具有良好的緩釋作用。Ban 等[32]以殼聚糖和羧甲基纖維素為壁材，采用真空冷凍干燥法包埋生姜精油，結果表明制備的微膠囊具有較好的微觀結構和包埋率，能保持較高的營養品質。微膠囊制備的常用方法有噴霧干燥法和冷凍干燥法，噴霧干燥具備快速、靈活、低成本等優點，但其進出風口的高溫易破壞熱敏類物質的分子結構，而真空冷凍干燥方式由于其干燥過程中隔絕氧氣、低溫等特點，更有利于熱敏物質的結構保留[42]。本研究采用真空冷凍干燥方式制備的紫花苜蓿花色苷微膠囊，微膠囊包埋率高且貯藏效果較好。

本研究在單因素試驗的基礎上，依據Box-Behnken 組合試驗設計原理和響應面法對紫花苜蓿花朵粉末中花色苷提取條件進行優化，得出花色苷最佳提取工藝條件為：液料比31 mL·g?1、乙醇濃度61%、提取溫度65 ℃、提取時間25 min、超聲功率250 W。在此條件下花色苷提取量為1.581 mg·g?1。以麥芽糊精、黃原膠和阿拉伯膠作為壁材，采用冷凍干燥方式對紫花苜蓿花色苷進行微膠囊化，不同壁材的包埋率差異顯著，其中最優的壁材為麥芽糊精 ? 黃原膠=30 ? 1 (w : w)，包埋率可達到98.37%。微膠囊化的紫花苜蓿花色苷比未微膠囊化的穩定性好，加入膠體的壁材比只用麥芽糊精作為壁材包埋效果及貯藏特性更優，微膠囊化為擴大紫花苜蓿花朵中花色苷的應用提供了方法。