基于氧化應激反應探討芪葵顆粒對胰島素抵抗豚鼠腎臟損傷的保護作用

陳岐，余江毅

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

隨著人們生活水平的不斷提高，膳食結構也發生著巨大改變，糖分和脂肪的攝入越來越多，再加上人們生活作息規律的紊亂，糖尿病以及肥胖的患病率也在不斷增加。胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的能力低下，主要臨床表現為皮膚病理性損傷以及餐前低血糖［1］。實驗研究表明，糖尿病、肥胖、代謝綜合征等疾病的重要病理基礎與胰島素抵抗有著密切的關系，同時也是其發病的危險因素，另外也有研究表明，胰島素抵抗會造成腎臟損害，并且伴隨著一定的腎功能減退［1－3］。根據其臨床表現，胰島素抵抗可歸屬于消渴病的范疇，究其發病機制，主要是陰虛為本，燥熱為標［4］。芪葵顆粒是江蘇省中醫院自制中成藥，具有養陰益氣、清熱除濕之功效。本實驗主要從氧化應激的角度探討芪葵顆粒對胰島素抵抗豚鼠腎臟保護作用，以期為臨床治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性豚鼠40 只，體質量180～200 g，SPF 級，由南京江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017－0011。飼養環境：溫度（26 ±2）℃，濕度50%左右。

1.2 分組、造模及給藥

將40 只雌性豚鼠隨機分為空白組、高脂組、12H組、24H 組和芪葵顆粒組，每組各8 只。將豚鼠進行分籠飼養，4 只豚鼠為一籠。其中，空白組給予普通飼料喂養，其余各組全部給予高脂飼料喂養。空白組、高脂組接受全天候正常的自然光照射，實驗條件要嚴格堅守，避免其他人工光源造成影響。12H 組、24H 組、芪葵顆粒組則被放置于光控箱中進行飼養，選取鹵素燈作為人工光源。12H組給予12 h光照/12 h黑暗節律交替照射，采用光控箱中的控制器控制光照節律，每天自6時起開始照射，至18時自動切斷電源，進入12 h黑暗階段，周而復始；24H 組、芪葵顆粒組則給予24 h 光照照射。所有的光經檢測，照度大約為500 Lux。造模時長為6周。從第7周開始，芪葵顆粒組豚鼠給予芪葵顆粒治療，連續給藥4周，其余各組均保持原條件飼養。

藥物制備：芪葵顆粒（江蘇省中醫院制，蘇藥制字Z20130002，10 g/袋。藥物組成：生黃芪、黃蜀葵花、制何首烏），每只豚鼠需要灌胃5～6 mL 芪葵顆粒混合溶液。

1.3 觀察指標

1.3.1 空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）水平

末次給藥結束后，豚鼠禁食12 h，運用背中足靜脈采血法采血約0.5 mL，而后用魚躍牌一次性血糖試紙檢測相應的FBG值。

1.3.2 血清各項指標測定

按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，測定豚鼠血清中SCR、BUN、CRP 含量及空腹胰島素（Fasting serum lisulin，FINS）的表達水平。

1.3.3 胰島素抵抗（HOMA－IR）值

根據公式計算出各組豚鼠HOMA－IR值。

胰島素抵抗（HOMA－IR）值 = 空腹血糖水平 ×空腹胰島素水平/22.5

1.3.4 氧化應激指標測定

按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，測定豚鼠腎臟組織中MDA及SOD的表達。

1.3.5 HE染色檢測豚鼠腎臟組織病理學變化

取豚鼠腎臟組織，HE染色法檢測其病理學變化。

1.4 統計學分析

實驗所得的數據采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差法（One－way analysis of variance，One－way ANOVA）進行分析，P＜0.05 代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較

在計算HOMA－IR 值時，24H 組的HOMA－IR 值明顯高于其他組，說明本次實驗胰島素抵抗豚鼠模型構建成功。各組豚鼠的FBG、FINS 及HOMA－IR 值水平經比較發現，高脂組高于空白組，12H 組高于高脂組，24H組顯著高于12H組（P＜0.05）；與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經治療后，各項指標均明顯改善，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較（±s）

表1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組HOMA－IR 2.2±0.1 2.7±0.3 3.1±0.3 4.0±0.5#3.0±0.3*n8 8 8 8 8 FBG（mmol/L）6.0±0.3 6.6±0.2 7.1±0.3 7.9±0.3#7.1±0.4*FINS（mIU/L）8.0±0.4 9.3±1.1 9.9±0.6 11.4±1.4#9.5±0.9*

2.2 各組豚鼠血清中BUN、SCR及CRP水平比較

與12H 組豚鼠相比，24H 組豚鼠血清SCR、BUN 及CRP 水平明顯升高（P＜0.05），表明24H 組豚鼠腎功能下降，腎損傷及炎癥反應明顯。而與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經治療后，血清SCR、BUN 及CRP 水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組豚鼠BUN、SCR及CRP水平比較（±s）

表2 各組豚鼠BUN、SCR及CRP水平比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組CRP（μg/L）158.2±12.1 165.9±15.1 176.0±10.6 90.0±13.8#161.3±6.9*n8 8 8 8 8 SCR（pmol/L）42.53±3.55 45.53±2.29 46.38±2.91 50.55±1.75#43.38±2.71*BUN（μmol/L）1137±95 1251±60 1272±56 1380±52#1212±59*

2.3 各組豚鼠腎臟組織SOD及MDA水平比較

與12H 組比較，24H 組豚鼠腎臟組織中MDA 水平明顯升高，SOD 水平明顯下降（P＜0.05）。而與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經治療后，腎組織MDA 水平明顯下降，SOD 水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組豚鼠腎組織氧化應激水平比較（±s）

表3 各組豚鼠腎組織氧化應激水平比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組MDA（nmol/L）12.95±1.41 13.54±1.64 14.34±1.20 16.37±0.21#13.29±0.61*n8 8 8 8 8 SOD（U/mL）7.13±0.16 5.91±1.01 5.16±1.01 3.83±0.19#6.21±0.74*

2.4 各組豚鼠腎臟組織HE染色比較

空白組豚鼠腎臟組織結構清晰，腎小球體積正常，厚薄均勻，腎組織未見明顯異常；高脂組豚鼠腎小球體積增加，腎小管管壁細胞體積增大，管腔變窄；12H 組豚鼠腎組織可見系膜細胞及系膜基質細胞增生，腎球囊變窄，腎小管管腔變小，管壁增厚；與12H 組相比，24H 組豚鼠腎組織除腎小球體積增大、系膜細胞及系膜基質細胞增生、腎球囊變窄、腎小管管腔變小、管壁增厚之外，管壁還可見顯著空泡變性；而芪葵顆粒組經治療后，腎臟結構明顯改善，只見腎小管細胞略腫脹，腎小管形態未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組豚鼠腎臟HE染色圖（×400）

3 討論

豚鼠又名天竺鼠，常被作為研究心臟病、動脈粥樣硬化、關節炎、免疫疾病以及藥物研發的模型［5－6］。豚鼠具有十分敏銳的視覺系統，作為嚙齒類動物，豚鼠的視錐細胞十分豐富，占光感受器的8%～17%［7］。同時，豚鼠對高脂食物的反應與人類極為相似，飼料中加入少量的膽固醇（最低可達0.04%）即可形成較為明顯的高膽固醇血癥，尤其血漿LDL－C 升高變化最為顯著，這種較低劑量膽固醇攝入形成的高脂血癥與人類高脂血癥患者的日常膳食膽固醇攝入量相當［8］。不僅如此，豚鼠對高脂飲食比一般大鼠、小鼠更為敏感［9］，因此，用高脂飼料喂養豚鼠構建模型比一般的SD大鼠時間短，而且豚鼠體型較大，取材也更加方便。因此，本次研究選取豚鼠作為建立胰島素抵抗的動物模型。

氧化應激（Oxidative stress，OS）是指機體在遭受內外環境的刺激后，活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）和其類似物產生過多，從而導致機體氧化系統與抗氧化系統之間的嚴重失衡，最終導致機體的損傷［10－11］。機體在高血糖狀態下可通過兩種途徑誘導氧化應激：一是高血糖誘導自身氧化，這是體內ROS增多的主要原因；二是誘導體內抗氧化酶糖基化［12］，導致體內抗氧化酶活性降低或消失。氧化應激可減少血管內皮舒張因子的生成以及生物利用度，引發腎小球血管內皮功能受損，加速腎小球硬化，此外還可促進糖化產物的生成，造成腎小球結節性病變［13］。另一方面，腎臟是一個高度代謝的器官，在線粒體中富含氧化反應，這也使得它容易受到氧化應激造成的損害，一些研究也證明了氧化應激可以加速腎臟疾病的進展［14－15］。SOD為抗氧化系統的重要一員，可清除氧自由基，阻斷其對機體造成的損害，通常認為SOD 水平可以代表機體的抗氧化水平［16］。MDA是ROS與生物膜脂質中多聚飽和脂肪酸發生過氧化反應，由脂質過氧化物分解而成的［17］，因此常用MDA 與SOD 水平來評價機體抗氧化應激的能力。

本實驗研究結果顯示，芪葵顆粒可明顯改善豚鼠胰島素抵抗狀態，改善腎臟損傷癥狀，降低血清BUN、SCR 及CRP 水平，降低腎組織中MDA 水平，上調SOD水平。由此可見，芪葵顆粒具有明顯的改善腎臟損傷、抗炎和抗氧化的作用，能通過調控氧化應激反應對胰島素抵抗豚鼠的腎臟起到保護作用。