龜甲膠對環磷酰胺引起的貧血大鼠的改善作用研究

胡海林，肖丹，2，王磊，何清湖，唐宇，*

（1.湖南中醫藥大學 湖南 長沙 410208；2.長沙市中醫醫院 湖南 長沙 410004；3.衡陽東健藥業有限公司 湖南 衡陽 421431；4.湖南醫藥學院 湖南 懷化 418000）

貧血是指單位容積循環血液中紅細胞、血紅蛋白含量低于正常參考值下限引起的一系列臨床綜合征。調查顯示，貧血影響著世界1/4 的人口，中國居民貧血的平均患病率為20.1%［1－2］。貧血發病緩慢，沒有特異性的臨床表現，是造成成年人生產力降低與青少年生長發育異常的重要原因之一［3－4］。貧血在中醫學中多歸屬于“血虛”“虛勞”的范疇，多因先天不足、脾胃虛弱、后天失養等導致氣血生化不足，進而引發一系列臟腑失養的虛弱病癥［5］。

龜甲膠是由烏龜腹甲經煎煮、濃縮后制成的固體膠，其味咸、甘，性微寒，歸肝、腎、心經，具有滋陰潛陽、補血止血、益腎健骨的功效，被《神農本草經》列為上品。本研究擬通過觀察龜甲膠對貧血大鼠模型的作用，研究龜甲膠改善貧血的效果與作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠72 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質量180～220 g，采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019－0004，動物質量合格證號：430727201101698051。分籠飼養于湖南中醫藥大學SPF 級動物房，實驗單位許可證編號：SYXK（湘）2019－0009。自由飲水攝食，飼養實驗室溫度18～26 ℃，濕度55%左右，每日常規飼料喂養。

1.2 主要藥物及試劑

龜甲膠（湖南東健藥業有限公司，批號：20200901）；注射用環磷酰胺（德國安道生，批號：0E387A）；利可君片（江蘇吉貝爾藥業股份有限公司，批號：20030303）；EPO試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：B18031506）；GM－CSF 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：B19031507）；蘇木素、伊紅（Wellbio公司）。

1.3 主要設備

獸用全自動血液細胞分析儀（邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：BC－2800vet）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，貨號：H1650R）；全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，貨號：PW－812）；多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，貨號：MB－530）；電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，貨號：DHP－500）。

1.4 分組造模與給藥

將72只SD大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數表法分為空白組、模型組、利可君組、龜甲膠低劑量組、龜甲膠中劑量組和龜甲膠高劑量組。每組12 只，雌雄各半。除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射環磷酰胺（給藥劑量為400 mg/kg），每日1 次，連續3 d，從第4 天開始改為隔日1 次，再行注射3 次，建立再生障礙性貧血大鼠模型。

造模成功后，按照人與大鼠的體表面積換算相應劑量灌胃。空白組與模型組大鼠給予生理鹽水；利可君組給予用生理鹽水配置的40 mg/mL 利可君片溶液；龜甲膠低、中、高劑量組，分別給予0.063、0.126、0.252 g/mL 的龜甲膠藥液。各組大鼠分別以10 mL/kg的劑量給予相應溶液灌胃，每日1次，連續15 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 外周血象測定

末次給藥24 h 后，以10%水合氯醛按照35 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用手術剪沿大鼠下腹部正中剪開，于腹主動脈采血，以EDTA 抗凝后用全自動血液細胞分析儀檢測外周血中的白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）含量。

1.5.2 血清促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）測定

腹主動脈采血后靜置2 h，以3 500 r/min 的速度離心20 min 后分離出血清，然后用移液槍吸取上層血清置于EP 管內，冰箱內保存待檢。按照ELISA 試劑盒說明書方法測定大鼠血清中EPO的含量。

1.5.3 RT－qPCR法檢測腎臟EPO mRNA表達

采用Trizol提取腎臟組織總RNA，以組織總mRNA為模板，逆轉錄cDNA，采用SYBR 染料法進行擴增，反應條件：95 ℃變性10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 個循環，溶解曲線分析60～95 ℃，每0.5 ℃一循環檢測熒光信號，以β－actin 為內參，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量。目的基因的序列及引物序列見表1。

表1 RT－qPCR反應引物序列及產物長度

1.5.4 脾臟組織細胞病理形態結構觀察

取大鼠脾臟組織，多聚甲醛固定，24 h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察脾臟組織細胞病理形態結構變化。

1.6 統計學方法

用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，先檢測各組數值符合正態分布，然后進行單因素方差齊性檢驗，再進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者采用Dunnett－t3檢驗。P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果2.1 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較

與空白組比較，模型組大鼠WBC、RBC、HGB 降低（P＜0.01），PLT 升高（P＜0.01）；與模型組相比，龜甲膠各組WBC、RBC、HGB 均升高（P＜0.01），利可君組大鼠WBC、RBC、HGB 升高（P＜0.01），給藥各組PLT改善不明顯（P＞0.05）；龜甲膠低劑量組對大鼠WBC升高顯著高于龜甲膠中、高劑量組（P＜0.05），各個劑量龜甲膠組之間RBC 和HGB 含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較（±s）

表2 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05；與低劑量組比較，**P ＜0.05。

組別空白組模型組利可君組龜甲膠低劑量組龜甲膠中劑量組龜甲膠高劑量組PLT/（×1012/L）6.84±1.31 11.99±2.51*16.66±5.38 17.37±5.56 15.26±3.22 18.00±4.37 n 12 8 8 1 0 9 11 WBC/（×109/L）10.87±2.21 1.94±0.72*19.60±6.18 22.88±9.51△14.15±5.38△**17.87±4.80△**RBC/（×1012/L）6.76±0.35 4.18±0.86*5.75±0.61△6.00±0.57△5.43±0.51△6.12±0.41△HGB/（g/L）148.75±10.51 99.61±8.86*128.88±9.57△130.10±3.75△124.67±10.90△131.17±12.53△

2.2 各組大鼠血清EPO的含量比較

與空白組相比較，模型組大鼠血清中EPO 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，龜甲膠各組及利可君組大鼠血清中EPO 含量顯著增高（P＜0.01）；龜甲膠中、高劑量組較龜甲膠低劑量組增加更明顯，但差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠脾臟組織細胞病理形態結構比較

空白組大鼠脾臟結構致密，白髓與紅髓結構清楚且分界明顯，淋巴小結邊界清晰，淋巴細胞排列致密整齊，細胞未見明顯的分裂分化現象。模型組大鼠脾臟結構紊亂，紅髓與白髓界限模糊不清，細胞出現明顯的分裂分化現象。與模型組比較，利可君組及龜甲膠各組大鼠的脾臟均得到不同程度的修復，白髓與紅髓結構與界限較為明顯，細胞分裂分化現象比較少見。見圖1。

圖1 各組大鼠脾臟組織細胞病理形態結構（HE染色，×100）

2.4 各組大鼠腎臟EPO mRNA表達水平比較

與空白組相比較，模型組大鼠腎臟中EPO mRNA表達顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，利可君組及龜甲膠各組大鼠腎臟中EPO mRNA 表達均顯著上升（P＜0.05），龜甲膠中劑量組腎臟EPO mRNA 表達較龜甲膠高、低劑量組提升更多，但差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 龜甲膠對大鼠血清EPO含量及腎臟EPO mRNA表達的影響（±s）

表3 龜甲膠對大鼠血清EPO含量及腎臟EPO mRNA表達的影響（±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05。

組別空白組模型組利可君組龜甲膠低劑量組龜甲膠中劑量組龜甲膠高劑量組腎臟EPO mRNA 0.137±0.046 0.021±0.006*0.153±0.027△0.130±0.037△0.231±0.082△0.103±0.020△n 12 8 8 1 0 9 11血清EPO（ng/mL）0.339±0.046 0.021±0.039*0.464±0.100*△0.412±0.120△0.459±0.180*△0.455±0.151*

3 討論

環磷酰胺作為臨床上常用的一種烷化劑類化療藥物，能夠通過發生烷化反應抑制DNA 復制和轉錄，造成骨髓抑制，從而導致貧血［6－7］。環磷酰胺腹腔注射造成大鼠貧血的方法簡單易行，時間短，模型穩定［8］。本研究中模型組大鼠血常規檢測顯示，外周血中WBC、RBC、HGB 含量下降，這與錢宏梁等［9］的研究結果相似。筆者認為PLT含量的增加可能與對模型組及給藥各組行腹腔注射及灌胃時，引起大鼠劇烈掙扎導致小血管破裂，從而激活大鼠凝血系統有關。

明代倪朱謨在《本草匯言》中記載，龜甲膠能治療一切陰虛血虛之證［10］。中醫學認為血是機體的重要組成部分，血液的生成主要有兩方面：一是水谷精微化赤而形成血液，二是精血互生，腎主骨生髓，精髓化生為血。龜甲膠，味咸、甘，性微寒，歸肝、腎、心經，因此常用來治療血虛證［11－13］。研究發現，龜甲膠中含有大量的有益于人體的礦物元素，如Fe、Zn 以及人體所必需的蛋白質、氨基酸等［14－16］。本次實驗中，通過給環磷酰胺造成貧血的大鼠灌服不同劑量的龜甲膠溶液，與模型組相比，龜甲膠組大鼠血象中WBC、RBC、HGB 均升高，且差異具有統計學意義（P＜0.01），高劑量組大鼠RBC、HGB 升高更明顯，低劑量組WBC 升高更明顯，但差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

EPO又稱紅細胞刺激因子，是一種由165個氨基酸組成、分子量為34 000的內源性酸性糖蛋白激素，主要來源于胎兒時期的肝臟，出生后主要在腎臟合成，其生物學作用主要是促進紅系祖細胞的增殖、分化和成熟［17－18］。本研究結果表明，與空白組相比，模型組大鼠血清中EPO含量和腎組織中EPO mRNA的表達均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比較，利可君組和龜甲膠低、中、高劑量組大鼠血清中EPO含量和腎組織中EPO mRNA 的表達均顯著增高（P＜0.05）。這可能是因為環磷酰胺具有細胞毒性，腹腔注射后損傷了大鼠的腎臟細胞，其中EPO mRNA表達降低，導致血液中EPO含量也相應降低。通過灌服不同劑量的龜甲膠后，龜甲膠中的成分對腎臟及骨髓進行了修復，EPO mRNA 表達升高，合成更多的EPO 入血。并且脾臟是人體最常見的免疫造血器官之一，造血功能低下會導致脾臟中骨髓細胞的積聚［19］。各組大鼠脾臟組織細胞病理形態顯示，與空白組相比，模型組大鼠脾臟組織結構紊亂，紅髓與白髓界限模糊不清，通過給予龜甲膠溶液后，各組大鼠脾臟的組織細胞結構均得到不同程度的修復。

綜上所述，龜甲膠能夠顯著改善大鼠因環磷酰胺腹腔注射而導致的貧血，增加外周血中WBC、RBC 和HGB 的含量，提高大鼠腎臟中EPO mRNA 表達和血液中EPO 的含量，這為龜甲膠治療貧血的機制研究與臨床應用提供了一定的思路與理論基礎。