伊木薩克提取物及其組合物對復(fù)合應(yīng)激性ED大鼠陰莖組織中ET-1與eNOS、nNOS表達(dá)的調(diào)控作用研究*

侯鵬程 阿卜杜熱伊木江·如則 毛吾蘭·買買提依明 劉文娟 斯依提·阿木提 阿地力江·伊明**

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（新疆 烏魯木齊 830011）2．新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指陰莖持續(xù)（至少6個月）不能達(dá)到或維持充分的勃起以獲得滿意的性生活，以陰莖不舉或舉而不堅為主要特征，并常伴有性欲減低和早泄等癥狀，屬于男科最常見的疾病之一[1,2]。前期工作中，我們以環(huán)境雌激素污染與西北地區(qū)寒冷這一氣候特點為切入點，采用雌激素樣飼料聯(lián)合冷應(yīng)激復(fù)合干預(yù)方法建立了復(fù)合應(yīng)激性ED大鼠模型[3]，并結(jié)合伊木薩克片的干預(yù)進(jìn)行了系列研究，初步揭示了復(fù)合應(yīng)激性ED的發(fā)病機制與伊木薩克片的有效性[4,5]。現(xiàn)為推動該藥的二次研發(fā)，我們對該藥處方原藥材采用不同方法進(jìn)行了提取，并獲得醇提物（alcohol extract,AE）、水提物（water extract,WE）和提取物組合物（combination of extracts，COE）[6]，隨后我們在復(fù)制復(fù)合應(yīng)激性ED模型并研究其NO-cGMP通路與神經(jīng)內(nèi)分泌改變的基礎(chǔ)上，對伊木薩克提取物及其組合物進(jìn)行了藥效評價和活性跟蹤，并進(jìn)一步探討其對ED相關(guān)指標(biāo)的調(diào)控作用。本文現(xiàn)對復(fù)合應(yīng)激性ED大鼠陰莖組織中ET-1、eNOS和nNOS蛋白表達(dá)改變與伊木薩克提取物及其組合物的調(diào)控作用的研究結(jié)果報道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

雄性清潔級SD大鼠160只和雌性大鼠20只，體質(zhì)量（230±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

（二）主要實驗儀器

人工氣候室（西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司，新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）,2135型切片機（德國萊卡）。

（三）主要試劑和藥物

1.主要試劑：鼠單克隆NOS1、NOS3抗體（sc5302，sc376542，Santa Cruz，美國），小鼠單克隆抗體anti-ET-1（ab2786，abcam，美國），兔單克隆抗體anti-GAPDH（ab181602，abcam， 美 國）， 山 羊 抗 小 鼠/兔IgG（ZB-2305/ZB2301，北京中杉金橋公司），通用型SP試劑盒（SP-9000，中杉金橋），酒精、氯化鈉等常規(guī)試劑及耗材均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.藥物：伊木薩克水提物、醇提物和提取物組合物由研究團(tuán)隊提供（專利號：CN202010285248.2）；伊木薩克片（20170702，和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司）。

二、方法

（一）實驗動物準(zhǔn)備

從經(jīng)過交配實驗證實具有正常性功能的160只性成熟雄性SD大鼠中隨機抽取15只作為正常對照（N）組，其余145只SD大鼠作為造模（M）組，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）°C，濕度為（55±5）%。

（二）環(huán)境雌激素樣飼料的制備

按每1 kg大鼠常規(guī)飼料中加入芫荽籽和菠菜籽各150 g，飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

（三）復(fù)合應(yīng)激大鼠模型的建立與ED模型的篩選

正常對照組以常規(guī)方法飼養(yǎng)，每日提供500g普通飼料、1000ml水、200g墊料。造模組以10:00-22:00/22:00-10:00為時間標(biāo)準(zhǔn)分2個時間段交替放入溫度為（8±2）℃、濕度為（85±5）%的人工氣候室中，每日給予500 g雌激素樣飼料，水與墊料同上。造模組與正常組均隨機飲食水，以12小時為周期模擬晝夜給予人工照明。在動態(tài)檢測大鼠性功能改變的基礎(chǔ)上，于造模35w后，通過交配實驗篩選出ED模型，共106只，成模率為73.1%。

（四）分組與藥物干預(yù)

將篩選出的ED大鼠模型隨機分為ED組（12只）、AE組（12只）、WE組（12只）、COE組（12只）及Yimusake組（12只），并設(shè)立N組（15只）。其中Yimusake組則以伊木薩克片按照250mg/kg劑量進(jìn)行干預(yù)，AE組、WE組及COE組按照伊木薩克片給藥劑量×相應(yīng)提取物出膏率確定給藥劑量，即醇提物（67.88mg/kg）、水提物（18.7mg/kg）、提取物組合物（86.58mg/kg）進(jìn)行干預(yù)，ED組和N組予以等劑量蒸餾水灌胃，干預(yù)周期3周，給藥頻率為1次/日。

（五）標(biāo)本采集

干預(yù)結(jié)束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（40mg／kg體質(zhì)量）進(jìn)行麻醉，迅速取下陰莖組織，后半部分于福爾馬林溶液中保存；前半部分置于2ml凍存管，速凍于液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

（六）免疫組織化學(xué)檢測

標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟至水。pH 9.0 EDTA-Tris緩沖溶液進(jìn)行抗原修復(fù)；3%H2O2去離子水孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。去除封閉液并滴加ET-1、nNOS和eNOS一抗液，4℃過夜。PBS清洗，滴加通用型二抗（山羊抗鼠IgG-HRP），室溫孵育30 min。PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶（三抗），室溫孵育30 min。PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素染色，氨水返藍(lán)，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。結(jié)果采用量化評分方法，細(xì)胞中的染色密度分別賦予分值:0(陰性)，1(弱陽性)，2(中陽性)，3(強陽性)，染色范圍分別賦予分值:0(＜5%)，1(5%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(＞75%)。每個樣本的免疫組化量化結(jié)果=1×(%弱陽性)+2×(%中陽性)+3×(%強陽性)，因此量化結(jié)果在0(無免疫反應(yīng))到300(最大免疫反應(yīng))之間。

（七）蛋白免疫印跡法檢測

取凍存陰莖組織約100mg，剪碎，加RIPA裂解液，冰上裂解，4℃，12000rpm離心15min，BCA法檢測蛋白濃度，變性。取200μg于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中250mA恒流電泳至分離膠底端;恒定電壓、4℃轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h。一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后山羊抗小鼠熒光二抗室溫孵育2h；內(nèi)參GAPDH一抗4℃孵育過夜，山羊抗兔熒光二抗室溫孵育2h，再次洗膜后分別于Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，采用ImageJ軟件分析，以目的蛋白／GAPDH條帶吸光度值作為蛋白表達(dá)強度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用以x±S表示，多組數(shù)據(jù)做正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件，采用單因素方差分析（ANOVA），如不滿足條件，求出秩次進(jìn)行方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組化檢測結(jié)果

（一）ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

ET-1主要表達(dá)在大鼠陰莖海綿體竇及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞胞核和胞漿中,陽性表達(dá)呈棕黃色胞核及淡黃色胞漿。圖1可見，ET-1在各組大鼠陰莖組織中均有表達(dá)，其中在ED組表達(dá)量較N組顯著升高（P＜0.05）。干預(yù)后，WE、COE和Yimusake組的表達(dá)量較ED組顯著降低（P＜0.05），同時WE和COE組與N組之間無顯著差異（P＞0.05），且低于AE和Yimusake組（P＜0.05），見圖1，表1。

圖1 各組大鼠陰莖組織ET-1免疫組化結(jié)果（×400）

表1 各組大鼠陰莖組織中ET-1、nNOS、eNOS的表達(dá)量（x±S）

（二）eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

eNOS主要表達(dá)在陰莖海綿體血管、海綿竇內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中亦有表達(dá)，陽性表達(dá)呈棕黃色。圖2結(jié)果顯示，eNOS在各組大鼠陰莖組織中均有表達(dá)，其中ED組的表達(dá)量較N組顯著降低（P＜0.05）。干預(yù)后，AE、WE、COE和Yimusake組的表達(dá)量均較ED組顯著升高（P＜0.05），并顯著高于N組（P＜0.05），各干預(yù)組之間則無顯著性差異（P＞0.05），見圖2，表1。

圖2 各組大鼠陰莖組織eNOS免疫組化結(jié)果（×400）

（三）nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

nNOS主要表達(dá)在海綿體平滑肌及血管壁、海綿竇內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中亦有表達(dá)，陽性表達(dá)呈棕黃色。由圖3可見，nNOS在各組大鼠陰莖組織中均有表達(dá)，其中，ED組的表達(dá)量較N組顯著降低（P＜0.05）。干預(yù)后，AE、WE、COE和Yimusake組均較ED組顯著升高（P＜0.05），同時可見，COE組顯著高于WE和N組（P＜0.05），并與Yimusake和AE組間無顯著性差異（P＞0.05），見圖3，表1。

圖3 各組大鼠陰莖組織nNOS免疫組化結(jié)果（×400）

二、免疫印跡檢測結(jié)果

在24KD、155KD和140KD附近分別檢測出ET-1、nNOS和eNOS各亞型特異性條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，采用軟件定量分析ET-l、eNOS和nNOS的蛋白表達(dá)。結(jié)果如下：

（一）ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

如圖4所示，ET-1在ED組的表達(dá)較N組顯著升高（P＜0.001），干預(yù)后，COE和WE組較ED組顯著降低（P＜0.001），同時也顯著低于AE組（＜0.001），且與N組之間無顯著性差異（P＞0.05）。Yimusake和AE組與ED組之間無顯著性差異（P＞0.05），同時顯著高于N組（P＜0.001），見圖4。

圖4 ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)

（二）eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

如圖5所示，eNOS在ED組的表達(dá)量較N組顯著降低（P＜0.001），經(jīng)干預(yù)后，COE、AE和Yimusake組較ED組顯著升高（P＜0.001），并且COE、AE和Yimusake組顯著高于N組（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），同時三組之間無顯著性差異（P＞0.05）。WE組顯著高于ED組，并與N組之間無顯著性差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)

（三）nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)結(jié)果

如圖6所示，nNOS在ED組的表達(dá)量較N組顯著降低（P＜0.001），經(jīng)干預(yù)后，COE、AE和Yimusake組較ED組顯著升高（P＜0.001），并顯著高于N組（P＜0.001），同時三組之間無顯著性差異（P＞0.05），而WE組與ED組之間比較，無顯著性差異（P＞0.05），見圖6。

圖6 nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達(dá)

討 論

ED作為男科常見疾病，病因很多且較復(fù)雜，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示[7]，與ED發(fā)病有關(guān)的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系統(tǒng)疾病和精神疾病等，同時，圍繞上述病因所導(dǎo)致的ED方面的研究也相對較多，但是關(guān)于環(huán)境激素和冷刺激對男性陰莖勃起功能影響的研究較少，故前期工作中，我們以冷刺激聯(lián)合環(huán)境雌激素樣飼料復(fù)合干預(yù)的方法建立了復(fù)合應(yīng)激性ED大鼠模型，在對該模型進(jìn)行綜合評價的基礎(chǔ)上，對其行為學(xué)與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)改變進(jìn)行過報道[3,8]，隨后，運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對該模型伊木薩克片干預(yù)前后陰莖組織差異表達(dá)蛋白及伊木薩克片的調(diào)控作用進(jìn)行了生物信息學(xué)分析與報道，得出陰莖組織中血管內(nèi)皮及平滑肌功能改變可能是復(fù)合應(yīng)激性ED發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制，并與炎癥相關(guān)，初步確定MAP1、BGN等候選蛋白標(biāo)志物和伊木薩克片藥物干預(yù)的蛋白靶點，但具體的機制尚有待于進(jìn)一步研究[9]。

陰莖勃起是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下的一系列血管平滑肌舒張反應(yīng)，其中血管內(nèi)皮發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。中樞和外周神經(jīng)以及陰莖海綿體內(nèi)竇隙及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放一些舒張與收縮因子，二者之間的平衡對平滑肌狀態(tài)有重要影響[10]。ET-1是目前發(fā)現(xiàn)的最強的血管收縮因子之一，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，對于血管具有較強的促進(jìn)收縮及促進(jìn)血管平滑肌增殖的作用,且在促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖分裂的同時,能介導(dǎo)各種平滑肌收縮，包括海綿體平滑肌、尿道海綿體平滑肌等[11]，因此，血管功能異常致ET-1水平升高在ED的病理生理機制中有著重要的作用。而一氧化氮（Nitric Oxide，NO）則是分布在陰莖的副交感和非腎上腺素非乙酰膽堿能神經(jīng)末梢、血管和陰莖海綿體竇內(nèi)皮細(xì)胞在NOS催化下釋放的一種可溶性氣體分子，為主要的舒血管因子，在激活NO-cGMP通路，誘發(fā)陰莖勃起中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。本研究結(jié)果中免疫組化和免疫印跡結(jié)果均顯示，該ED模型陰莖組織中ET-1的表達(dá)量較N組顯著升高，而eNOS和nNOS則顯著降低，結(jié)果提示，內(nèi)皮功能受損，并導(dǎo)致ET-1表達(dá)升高和NO產(chǎn)生減少可能是復(fù)合應(yīng)激條件下導(dǎo)致ED發(fā)生的重要病理機制之一。具體而言，可能和ET-1表達(dá)增加，從而進(jìn)一步激活ETA和ETB受體，并使細(xì)胞加速Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致海綿體平滑肌持續(xù)性收縮，血流減少有關(guān)。同時，eNOS及nNOS表達(dá)降低，導(dǎo)致NO生成減少，平滑肌細(xì)胞舒張功能減退，進(jìn)而產(chǎn)生ED。至于兩者之間是否相互影響，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究，但有文獻(xiàn)報道[12,13]，ET-1可通過與陰莖組織上的特異性受體結(jié)合，加速Ca2+內(nèi)流，并影響NO的生成，導(dǎo)致陰莖海綿體持續(xù)性收縮的同時，還能抑制內(nèi)皮NO的生物利用度，促進(jìn)陰莖動脈的收縮，并進(jìn)而導(dǎo)致ED。

經(jīng)伊木薩克片和伊木薩克不同提取物及組合物干預(yù)后，結(jié)果顯示，COE、WE和Yimusake組中ET-1的表達(dá)較ED組均顯著降低，同時COE和WE組與N組之間無顯著差異，且顯著低于AE和Yimusake組。提示，COE、WE和伊木薩克片均可通過降低ET-1發(fā)揮治療作用，同時COE和WE較AE和伊木薩克片而言調(diào)控ET-1效果更顯著。COE、AE和Yimusake組中eNOS及nNOS表達(dá)均較ED組顯著升高，并顯著高于N組，同時COE組nNOS表達(dá)亦顯著高于Yimusake組，該結(jié)果提示，COE、AE和伊木薩克片均可通過升高eNOS和nNOS表達(dá)來發(fā)揮治療作用，具體可能和進(jìn)一步激活NO-cGMP通路相關(guān)，同時也表明COE調(diào)控nNOS的效果優(yōu)于伊木薩克片。

綜上所述，在復(fù)合應(yīng)激性ED的發(fā)生發(fā)展中，從陰莖這一效應(yīng)器官角度而言，陰莖組織中ET-1和eNOS、nNOS表達(dá)改變可能是關(guān)鍵病理學(xué)機制，結(jié)合以往的研究，我們認(rèn)為具體原因可能和復(fù)合應(yīng)激條件下產(chǎn)生慢性炎癥，并進(jìn)一步引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能改變有關(guān)，但需進(jìn)一步研究證實。伊木薩克提取物及其組合物，以及伊木薩克片可通過調(diào)控ET-1與nNOS、eNOS表達(dá)水平來發(fā)揮治療作用，經(jīng)綜合分析，COE的整體調(diào)控作用優(yōu)于伊木薩克片，該結(jié)果為伊木薩克的二次研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。