人類抗原R、中心體蛋白激酶2在前列腺癌中的表達及其臨床價值

魯博陽 趙 慶 單鏡源 陳向峰 羅振國

佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科（黑龍江 佳木斯 154003）

根治性前列腺切除術是前列腺癌的標準治療方法，但是，在部分病例中，該疾病遵循侵襲性病程，患者具有疾病復發，轉移和與癌癥相關的死亡[1-2]。前列腺癌中被放松調節或與不良結果相關的分子標志物的鑒定有助于評估潛在的新型治療靶標，這可能有助于個體化和改善高危患者的治療[3-4]。此外，已確定的預后因素如術前前列腺特異性抗原水平，但是其無法通過組織學分級，腫瘤分期，患者年齡和切除余量等臨床因素預測患者預后[5]。因此，需要額外的預后標志物來評估個體的預后情況并計劃個體化治療。已有研究通過蛋白質組學發現前列腺癌組織和癌旁組織有眾多表達差異蛋白[6]，包括人類抗原R（HuR）和中心體蛋白激酶2（NEK2）。HuR通過與特定的mRNA亞群相互作用，提高了以下蛋白的水平：(1)促進細胞增殖，(2)增加細胞存活，(3)提高局部血管生成，(4)幫助癌細胞逃避免疫識別，(5)促進癌細胞的侵襲和轉移[7]。NEK2參與有絲分裂細胞中中心體分離和雙極紡錘體形成以及減數分裂細胞中染色質凝結控制[8]。NEK2通過磷酸化中心體蛋白，如CROCC,CEP250和NINL，調節中心體分離，導致它們從中心體移位。但是HuR和NEK2對前列腺癌的臨床價值尚不明確。基于此，本研究探討人類抗原R(HuR)、中心體蛋白激酶2（NEK2）在前列腺癌及其癌旁組織中的表達及其臨床價值。

資料與方法

一、一般資料

納入2018年1月-2021年1月我院收治的前列腺癌患者95例為惡性腫瘤組，其中，大于等于60歲的有43例，小于60歲的有52例，平均年齡（55.32±13.32）歲；有家族史45例，無家族史50例；腫瘤最大徑大于等于5cm有58例，小于5cm有37例；組織學分級：G1和G2期共有34例，G3期有61例；精囊腺侵犯57例；臨床分期：A和B期共有46例，C和D期共有49例。所有患者先前均已通過對從原發灶獲取的活檢樣品進行組織病理學分析而診斷為前列腺癌。同時納入2018年1月-2021年1月我院收治的前列腺增生患者69例為良性組，平均年齡（52.45±11.39）歲。排除標準：①嚴重心、肝、腎功能損害者；②服用過內分泌藥物者；③患有其他腫瘤者；④患有精神疾病者。各組一般資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），可納入此次分析。本研究經醫院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

二、免疫組織化學

將手術所得的組織進行包埋和切片。將載玻片脫蠟，再水化，浸入3%過氧化氫溶液中15分鐘，在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中于95℃加熱25分鐘，然后于室溫冷卻60分鐘。在每個孵育步驟之間，將切片用PBS（pH 7.4）洗滌。將載玻片用10%正常山羊血清在37℃下封閉30分鐘，洗滌并在4℃下與抗HuR小鼠單克隆抗體（ab242410，abcam公 司），NEK2兔多克隆抗體（ab115731，abcam公司）結合。沒有添加一抗的玻片用作陰性對照。用PBS洗滌后，按照制造商的說明使用PV-9000聚合物檢測系統對玻片進行可視化，然后用蘇木精復染。

三、總RNA抽取與實時熒光定量PCR

通過TRIzol試劑（Ambion）從組織中提取總RNA。按照制造商的說明，通過GoScript逆轉錄（RT）系統（Promega）將總RNA逆轉錄為cDNA。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）用于通過Mx3005P實時PCR系統（Stratagene）上的GoTaq qPCR Master Mix（Promega）檢測HuR,NEK2,GAPDH水平。所有結果均表示為三個獨立實驗的平均值±標準差。

四、統計學分析

使用Python中pandas package進行統計學分析。使用t檢驗比較連續變量。Chi-square檢驗分析NEK2和HuR與前列腺癌患者臨床病理特征的相關性。應用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析HuR和NEK2 mRNA水平對區分前列腺癌患者臨床病理特征的效能。P＜0.05的差異被認為具有統計學意義。

結 果

一、前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的表達水平

腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的表達陽性率均高于良性組前列腺增生組織，見表1。腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的蛋白表達水平和mRNA表達水平均高于癌旁組織，見圖1和圖2。

表1 良性組和惡性腫瘤組中HuR和NEK2的表達陽性率

圖1 前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的蛋白表達水平

圖2 前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的mRNA表達水平

二、HuR和NEK2與前列腺癌患者臨床病理特征的相關性

腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的陽性表達與年齡、家族史無關（P＞0.05），而與腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期具有相關性（P＜0.05），見表2。

表2 HuR與NEK2與前列腺癌患者臨床病理特征的相關性

三、HuR和NEK2 mRNA水平對區分前列腺癌患者臨床病理特征的效能

為了評估HuR和NEK2 mRNA水平在前列腺癌患者臨床病理特征中的診甄別效能，將95例前列腺癌患者癌組織中HuR和NEK2 mRNA進行ROC分析。HuR mRNA水平在區別腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關性的靈敏度分別為85%、92%、80%、86%，特異度分別為78%、82%、83%、78%。NEK2 mRNA水平在區別腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關性的靈敏度分別為87%、89%、80%、83%，特異度分別為83%、85%、85%、82%，見表3。

表3 HuR和NEK2 mRNA水平與前列腺癌患者臨床病理參數的關系

討 論

前列腺癌是威脅男性健康的最常見的惡性腫瘤之一[7]。2012年，全世界大約有110萬人被診斷出患有前列腺癌[8]。據統計，美國每年約有220,800例新的前列腺癌病例，占男性惡性腫瘤的1/42。近年來，中國前列腺癌的發病率大大增加了[9]。盡管前列腺癌的篩查，診斷和治療技術取得了顯著發展，但其死亡率仍然很高[10]。主要原因是前列腺癌是一種典型的異質性疾病，其癥狀不明顯且進展緩慢。但是，也有一些前列腺癌患者癥狀會迅速發展，并且可能會轉移到骨骼或其他器官，最終導致相對較高的死亡率[11]。因此，迫切需要一些新的生物標志來指征前列腺癌的臨床特征。

在本研究中，發現腫瘤組受試人員癌組織中HuR和NEK2的表達陽性率均高于良性組受試人員前列腺增生組織（P＜0.05）。腫瘤組癌患者癌組織中HuR和NEK2的蛋白表達水平和mRNA表達水平均高于癌旁組織（P＜0.05）。提示HuR和NEK2的蛋白表達水平和mRNA表達水平可能成為新的前列腺癌特征的標志物。

本研究發現前列腺癌患者癌組織中HuR和NEK2的陽性表達與年齡因素、家族史因素無關（P＞0.05），而與腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關性（P＜0.05）。HuR是RNA結合蛋白Hu家族的成員，在許多細胞類型中普遍表達。HuR識別并結合含有腺苷和富含尿嘧啶元素的mRNA[12]。這些元素經常出現在幾種不穩定的轉錄本的3'非翻譯區域，這些轉錄本編碼細胞因子，細胞周期調節因子或原癌基因。HuR與mRNA的結合穩定了mRNA，并防止其被核酸外切酶快速降解[13]。因此，HuR可能是提高了促腫瘤發生發展中重要蛋白的mRNA的穩定性來促進腫瘤的發生發展。NIMA相關激酶2（NEK2）是細胞周期調節蛋白激酶家族的成員，屬于中心體相關蛋白激酶[14]。相關研究的學者發現了間期和有絲分裂期[15]。此外，大量研究表明，NEK2表達在多種腫瘤中異常升高[16]。此外，NEK2異常涉及惡性腫瘤的發生和發展的許多環節[17]。提示NEK2可以作為治療人類惡性腫瘤的潛在靶標。HuR mRNA水平在區別腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期相關性的靈敏度分別為85%、92%、80%、86%，特異度分別為78%、82%、83%、78%。NEK2 mRNA水平在區別腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關性的靈敏度分別為87%、89%、80%、83%，特異度分別為83%、85%、85%、82%，顯示了HuR和NEK2 mRNA水平較好的區分效能。

綜上所述，HuR和NEK2在前列腺癌組織中呈高陽性，與腫瘤最大徑、組織學分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關性，可作為前列腺癌患者臨床病理特征診斷和預后的潛在生物學標記分子。