基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)前列舒樂顆粒治療良性前列腺增生癥的作用機(jī)制探討*

劉勝京 杜冠潮 高慶和 張繼偉 晏 斌 趙 豐 郭 俊 郭 軍

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科（北京 100091）

良性前列腺增生癥 （benign prostatic hyperplasia,BPH）俗稱前列腺增生，是以前列腺中葉增生為實(shí)質(zhì)改變，突入膀胱或尿道內(nèi)，壓迫膀胱頸部或尿道，從而引起下尿路梗阻的一組癥候群，主要表現(xiàn)為尿頻、尿急和進(jìn)行性排尿困難等癥狀，是中老年男性的常見病與多發(fā)病[1]。BPH在中醫(yī)屬于“癃閉”范疇，在《素問·宣明五氣》云：“膀胱不利為癃”，主因膀胱氣化不利或氣化無權(quán)所致，病位主要在腎與膀胱，涉及三焦、肺、脾、肝，其中脾腎虛衰為重要病因之一[2]。

前列舒樂顆粒是由淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝5味藥材組成的上市中成藥，具有補(bǔ)腎益氣，化瘀通淋的功效，可用于腎脾雙虛、氣滯血瘀之BPH及慢性前列腺炎的治療[3]。目前臨床研究結(jié)果表明，前列舒樂顆粒對于BPH具有較好的治療效果。但是，前列舒樂顆粒作為中藥復(fù)方制劑，其所含活性成分較多，目前對其治療BPH的機(jī)制研究匱乏，不能從整體上反應(yīng)其多成分、多靶點(diǎn)治療BPH的作用特點(diǎn)，因此需要一項(xiàng)新的藥理學(xué)研究思路，從整體角度對前列舒樂顆粒治療BPH的作用機(jī)制進(jìn)行全面分析。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究藥物治療機(jī)制的一種手段，符合中藥治療疾病多靶點(diǎn)的思路，因此將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中藥作用機(jī)制研究相結(jié)合具有較好的優(yōu)勢及潛力。本研究以前列舒樂顆粒復(fù)雜化學(xué)成分為研究對象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)等方法預(yù)測前列舒樂顆粒有效成分的作用靶點(diǎn)，深入探討前列舒樂顆粒治療BPH的作用機(jī)制。

材料與方法

一、前列舒樂顆粒藥物活性成分的篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[4]（TCMSP，http://tcmspw.com）及中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺[5](TCMIP,http://www.tcmip.cn)收集前列舒樂顆粒中淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝的化學(xué)成分。以ADME參數(shù)中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為限制條件進(jìn)行篩選，并在PubMed及中國知網(wǎng)查閱相關(guān)藥物化學(xué)成分研究或綜述文章進(jìn)行檢驗(yàn)，補(bǔ)充未納入的重要成分，最后依據(jù)目前基于HPLC、LC/MS等方法已經(jīng)鑒定出的前列舒樂顆粒成分進(jìn)行比對補(bǔ)充，構(gòu)建前列舒樂顆粒的活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，并在PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）確認(rèn)其分子結(jié)構(gòu)。

二、藥物活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的獲取

通過pharmmaper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn），獲得活性成分最相關(guān)的靶點(diǎn)信息。利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫搜索疾病的靶點(diǎn)，關(guān)鍵詞設(shè)置為“benign prostatic hyperplasia”，獲得與BPH相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

三、藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射

利用R軟件，將上述得到的藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)相映射，得到前列舒樂顆粒治療BPH的潛在作用靶點(diǎn)。

四、靶點(diǎn)間相互作用分析

將映射后得到的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺（https://string-db.org），構(gòu)建靶點(diǎn)間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），選取最低相互作用閾值大于0.9的數(shù)據(jù)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)文件，將節(jié)點(diǎn)信息node與combined score值導(dǎo)入Cytoscape軟件，計(jì)算節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間相互作用值（degree值）并進(jìn)行圖形化展示，獲得最終PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

五、基因本體與通路富集分析

利用R軟件通過基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)對核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程及作用通路分析，并將結(jié)果以氣泡圖及圈圖的形式呈現(xiàn)。

六、“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-富集通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

根據(jù)上述分析得到的藥物活性成分、作用靶點(diǎn)及核心信號通路，利用Cytoscape軟件構(gòu)建前列舒樂顆粒“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-富集通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

一、篩選的前列舒樂顆粒藥物活性成分

基 于TCMSP、TCMIP數(shù) 據(jù) 庫，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對前列舒樂顆粒藥物成分進(jìn)行篩選，共得到65個(gè)化學(xué)成分，其中來源于淫羊藿23個(gè)、黃芪20個(gè)、蒲黃8個(gè)、車前草10個(gè)、川牛膝4個(gè)。通過進(jìn)一步閱讀文獻(xiàn)及依據(jù)目前基于HPLC、LC/MS等方法已經(jīng)鑒定出的前列舒樂顆粒成分[6-8]，黃芪中的黃芪甲苷（astragalosideⅣ），蒲黃中的香蒲新苷（typhaneoside）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside），車前草的大車前苷（plantamajoside），川牛膝中的杯莧甾酮（cyasterone），雖然OB或DL值較低，但均已被證實(shí)為相關(guān)藥物的主要活性成分，因此也被納入潛在的活性成分進(jìn)行分析。最終確定復(fù)方中共70個(gè)潛在活性成分，其中，淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝的潛在活性成分個(gè)數(shù)分別為23、21、10、11、5。

二、獲取的藥物活性成分作用靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)

通過pharmmaper數(shù)據(jù)庫獲得藥物的相關(guān)靶點(diǎn)，去重后共得到相關(guān)靶點(diǎn)134個(gè)。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得與BPH相關(guān)靶點(diǎn)共868個(gè)。

三、藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相映射

利用R軟件，將上述得到的134個(gè)前列舒樂顆粒的藥物靶點(diǎn)與868個(gè)與BPH相關(guān)度較高的疾病靶點(diǎn)相映射，得到61個(gè)前列舒樂顆粒治療BPH的潛在作用靶點(diǎn)。

四、靶點(diǎn)間相互作用分析

將映射后得到的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺，選取最低相互作用閾值大于0.9的數(shù)據(jù)，經(jīng)Cytoscape處理后得到PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖1。圖中節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺反映節(jié)點(diǎn)之間degree值的大小，顏色越深表示節(jié)點(diǎn)之間關(guān)系越強(qiáng)；節(jié)點(diǎn)之間的連線粗細(xì)反映了結(jié)合率評分（combined score）的大小，連線越粗表示節(jié)點(diǎn)結(jié)合率越高。通過PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析，可見蛋白互作頻次最高的為腫瘤抑制基因（TP53），其次激素受體如雄激素受體（AR）、雌激素受體（ESR1）、糖 皮 質(zhì)激素受體（NR3C1），5α還原酶（SRD5A），腎上腺素能受體Alpha1A（ADRA1A），生長因子相關(guān)受體（EGFR、ERBB2）、炎癥相關(guān)受體（RELA、IL6）、核蛋白轉(zhuǎn)錄因子（FOS）、特異性周期蛋白（CCND1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8）、核受體輔激活蛋白基因（NCOA1）、凋亡信號相 關(guān)分子（CASP3、CASP8、MYC）等，是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白。

圖1 共同靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

五、基因本體與通路富集分析

（一）核心靶點(diǎn)GO富集分析 對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，即從生物過程（biological process,BP）、細(xì)胞組分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）對基因功能進(jìn)行注釋，以顯著性（P）＜0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為條件篩選，發(fā)現(xiàn)核心基因主要富集在1285個(gè)BP、23種CC和92種MF。前列舒樂顆粒治療BPH的生物學(xué)過程包括類固醇激素反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路調(diào)節(jié)以及對酮、金屬離子及紫外線的反應(yīng)等；這些靶點(diǎn)在細(xì)胞組分中與膜閥、膜微孔、膜受體、核染色質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、激酶復(fù)合物有關(guān)；在分子功能中與蛋白連接酶、轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體活性、類固醇結(jié)合相關(guān)度較大。分別列出BP、CC、MF排名前10的富集結(jié)果，見圖2。圖中柱狀圖的高度代表富集的靶點(diǎn)數(shù)目，顏色深淺代表富集的顯著程度，顏色越紅代表顯著程度越高。

（二）核心靶點(diǎn)KEGG富集分析 對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，篩選條件同GO分析，共得到112條具有顯著意義的通路，這些通路主要與前列腺癌、細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌抵抗等相關(guān)通路有關(guān)，查閱文獻(xiàn)后挑選與BPH相關(guān)度較大的10條通路，并與相關(guān)基因進(jìn)行對應(yīng)，繪制圈圖分析，見圖3。圖中圓圈左半部分為與通路有關(guān)的基因；右半部分為與BPH相關(guān)度較高的通路；圓圈中間的線為通路與基因的對應(yīng)關(guān)系。因目前實(shí)驗(yàn)研究多從信號通路進(jìn)行探討，研究方法更為成熟，可操作性更強(qiáng)，故剔除疾病及廣義通路后，得到10條相關(guān)度最高的信號通路，納入網(wǎng)絡(luò)圖分析，見圖4。

圖2 核心靶點(diǎn)GO富集分析氣泡圖

六、“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-富集通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)前列舒樂顆粒中“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-富集通路”之間的關(guān)系，見圖4。圖中正方形代表藥物，菱形代表藥物活性成分，圓形代表作用靶點(diǎn)，箭形代表預(yù)測與BPH相關(guān)度較高的信號通路；顏色與大小根據(jù)degree值決定，顏色越深、形狀越大代表節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系越強(qiáng)，在網(wǎng)絡(luò)圖中的地位越重要。在圖4中可以看出，左側(cè)菱形部分為前列舒樂顆粒藥物治療BPH的主要活性成分，分為君藥（淫羊藿）、臣藥（黃芪）、佐使藥（蒲黃、車前草、川牛膝）以及藥物相同成分四個(gè)部分來表示，體現(xiàn)了中醫(yī)藥配伍中“君臣佐使”的配伍關(guān)系；中間圓形部分為前列舒樂顆粒治療BPH的預(yù)測靶點(diǎn)；右側(cè)箭形部分為前列舒樂顆粒治療BPH潛在相關(guān)度較高的信號通路。

圖3 核心靶點(diǎn)KEGG富集分析圈圖

討 論

傳統(tǒng)中藥復(fù)方的機(jī)理研究多針對某單一通路，通過實(shí)驗(yàn)手段逐一篩選作用靶點(diǎn)，存在選擇較為主觀及效率低下等問題，且中藥復(fù)方成分較多，往往不是單一對應(yīng)關(guān)系，因此中藥復(fù)方的機(jī)制研究適合從整體上把握其之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)等研究方法，對前列舒樂顆粒進(jìn)行深入研究，為藥物的動物實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步產(chǎn)品研發(fā)提供了較好的思路，同時(shí)也為臨床多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)方研究提供借鑒。

本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選得到前列舒樂顆粒的70個(gè)主要活性成分及134個(gè)作用靶點(diǎn)，與BPH作用靶點(diǎn)相映射后，得到61個(gè)藥物治療疾病的潛在靶點(diǎn)，說明前列舒樂顆粒治療BPH覆蓋范圍較廣。通過前列舒樂顆粒藥物分析及圖4的網(wǎng)絡(luò)圖，可以看出其君藥淫羊藿中的淫羊藿苷與臣藥黃芪中的毛蕊異黃酮（Calycosin）在網(wǎng)絡(luò)中均發(fā)揮重要作用。涂梅琳等[9]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對增生的前列腺組織有明顯抑制作用，且與劑量成正相關(guān)關(guān)系。而黃芪改善BPH的相關(guān)癥狀已有臨床研究[10]，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可明顯逆轉(zhuǎn)大鼠前列腺組織增生[11]，而作用機(jī)理可能為毛蕊異黃酮可降低血清中睪酮和二氫睪酮的濃度[12]。從圖4中可以看出，槲皮素為網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)，一項(xiàng)隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)證明槲皮素對減輕BPH癥狀，增加尿流率有較好的效果[13]。通過藥物成分及網(wǎng)絡(luò)圖分析，可以看出君藥及臣藥藥少力專，在網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)揮主要作用，佐使藥既輔助君藥及臣藥協(xié)同發(fā)揮作用，又有各自靶點(diǎn)獨(dú)立針對疾病發(fā)揮作用，藥物之間展示了良好的“君臣佐使”配伍關(guān)系。

目前關(guān)于BPH的發(fā)病機(jī)制主要有雌/雄激素對前列腺細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，上皮與基底細(xì)胞相互作用，生長因子作用以及炎癥等[14-15]。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，在網(wǎng)絡(luò)中處于重要節(jié)點(diǎn)位置的雄激素受體（AR）、雌激素受體、5α還原酶，α1型腎上腺素能受體、表皮生長因子受體及炎癥相關(guān)受體（RELA、IL6）等均已有相關(guān)研究證明與BPH有關(guān)[16-18]。前列腺為雄激素依賴性器官，而睪酮作為最重要的雄激素，可直接與AR結(jié)合產(chǎn)生生物活性，此外睪酮還可以與5α還原酶受體結(jié)合，被轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的雙氫睪酮促使前列腺的增生，因此抑制5α還原酶可減輕BPH的相關(guān)癥狀。并且有研究顯示，睪酮和雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化及與AR的結(jié)合會發(fā)生受體配體復(fù)合物的核轉(zhuǎn)位，同時(shí)招募其它輔助調(diào)節(jié)因子如NCOA1等與靶基因上的AR反應(yīng)原件結(jié)合，共同調(diào)控靶基因的表達(dá)。前列腺及膀胱頸平滑肌內(nèi)均有α受體分布，增生組織高于正常組織，且以α1A受體為主，其遞質(zhì)去甲腎上腺素釋放增加致平滑肌張力增強(qiáng)，膀胱頸及尿道內(nèi)壓力增高，排尿阻力增加，引起下尿路梗阻癥狀。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測前列舒樂顆粒治療BPH的相關(guān)生物活動的機(jī)制，分析結(jié)果與既往BPH發(fā)病機(jī)制吻合度高。前列舒樂顆粒可能通過抑制α受體活性，舒張尿道平滑肌張力，減輕膀胱頸及尿道內(nèi)壓力。同時(shí)抑制5α還原酶活性，調(diào)節(jié)血清及前列腺組織睪酮雙氫睪酮水平，降低血清及前列腺組織睪酮及雙氫睪酮含量、增加雌激素含量，抑制前列腺血管增生等途徑來起到治療BPH的作用。

KEGG通路分析較顯著的通路有前列腺癌通路、細(xì)胞凋亡通路、內(nèi)分泌抵抗通路，相關(guān)激素通路如雄激素信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路以及PI3K-Akt、MAPK、p53、TNF等通路，與已有BPH研究吻合度較高。PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖與代謝等多種生物學(xué)過程，與細(xì)胞生存及細(xì)胞分裂密切相關(guān)，通路激活后，使其底物發(fā)生磷酸化，并與蛋白結(jié)合發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡與促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[18]。有動物實(shí)驗(yàn)研究，阻斷PI3K-Akt信號通路具有抑制前列腺增生的作用[20,21]。MAPK信號通路是將信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)部的重要環(huán)節(jié)，其基于磷酸化的信號形式進(jìn)行三級激酶模式傳導(dǎo)，與免疫相關(guān)疾病、組織器官纖維化、個(gè)體發(fā)育、組織器官再生及癌癥發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。有研究表明，p38MAPK通路的活化參與了前列腺上皮和間質(zhì)增生的調(diào)控，在細(xì)胞增殖過程中引起生長因子及雄激素的缺乏，導(dǎo)致去除效應(yīng)從而激活p38通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以抵抗前列腺增生[22,23]。而PI3K-AKT與MAPK信號通路存在相互作用關(guān)系[24]，p38MAPK及PI3K-AKT通路可進(jìn)一步聯(lián)合分析以探究前列舒樂顆粒治療BPH的作用機(jī)制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)的分析方法，預(yù)測了前列舒樂顆粒治療BPH的作用機(jī)制，體現(xiàn)了前列舒樂顆粒治療BPH多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。本研究主要成分通過TCMSP及TCMIP篩選后進(jìn)行文獻(xiàn)校對，并經(jīng)HPLC、LC/MS等實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)其成分，藥物作用靶點(diǎn)通過PharmMapper服務(wù)器基于反向分子對接方法進(jìn)行預(yù)測，相比于僅依據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索成分及根據(jù)分子二維結(jié)構(gòu)相似性尋找靶點(diǎn)，預(yù)測結(jié)果更為準(zhǔn)確，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了更強(qiáng)有力的理論依據(jù)。