基于RNA測序研究雄激素對人包皮成纖維細胞基因表達的影響*

薛競東 俞仲偉 馮 超 謝 弘 李 鋒 王田龍 汪祖林**

1.上海市第八人民醫(yī)院（上海市第六人民醫(yī)院徐匯分院）泌尿外科（上海 200235）2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200233）

下泌尿道纖維化，尤其是膀胱頸部纖維化、尿道狹窄、陰莖海綿體硬結(jié)癥等在治療上較為棘手，技術(shù)要求高，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，所以對相關(guān)疾病發(fā)生的病因機制研究在臨床上是急需解決的課題之一。臨床上治療處理集中在改變大體解剖結(jié)構(gòu)層面，雖技術(shù)和方法不斷更新[1-2]，但療效往往不令人滿意，且疾病容易復(fù)發(fā)，究其原因主要是目前研究集中在組織工程修復(fù)，而對相關(guān)疾病本身發(fā)生、發(fā)展機制認識尚無明確定論，缺乏有效的措施防止疾病發(fā)生以及阻止術(shù)后復(fù)發(fā)。目前有研究認為雄激素參與心血管纖維化、肺纖維化等病理進展[3-4]。在泌尿系統(tǒng)相關(guān)疤痕纖維化形成過程中，主要為成纖維細胞等參與的過度修復(fù)造成，而在其中微環(huán)境中高雄激素可能扮演重要的角色。本研究擬通過目前較為熱門的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)深度分析雄激素處理人包皮成纖維細胞后差異性表達變化及其相關(guān)信號通路的影響。

材料與方法

一、主要細胞系及試劑

人包皮成纖維細胞系HFF-1細胞購自中科院細胞干細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol試劑盒購自上海普飛公司、M-MLV試劑盒購自美國promega公司。

二、細胞培養(yǎng)

將細胞用含15%胎牛血清，1%雙抗（青鏈霉素混合液）的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察97H細胞為貼壁細胞，臺盼藍染色活細胞率達95%以上。將對數(shù)生長期的HFF-1細胞用胰酶消化后以50萬細胞/孔的密度接入細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24小時后，吸棄原有培養(yǎng)基，貼壁的HFF-1用于后續(xù)實驗。

三、R NA提取和測序

HFF-1接種于6孔板中，實驗分為兩組：加等體積濃度0.5%乙醇（control組，下稱Ctrl組）與等體積含濃度0.5%乙醇的80nmol/L雙氫睪酮處理（drug組，下稱Drug組），每組3個復(fù)孔，6h后收集細胞，Trizol法提取總RNA，并進行質(zhì)量控制。按照美國Illumina生物技術(shù)公司RNA-seq樣本制備試劑盒說明構(gòu)建cDNA文庫。對照基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組信息，將測序出的reads比對到參考基因組上，進而對基因或轉(zhuǎn)錄本進行注釋和定量。將reads比對到基因組后，采用StringTie（2016）對表達進行注釋和定量。StringTie應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)流算法和可選的基因組denovo組裝，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉(zhuǎn)錄本。進一步計算基因和轉(zhuǎn)錄本的FPKM值（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment，即每百萬外顯子片段堿基映射獲得的基因表達）。

四、差異轉(zhuǎn)錄本分析

利用Ballgown對兩個不同處理組進行比較，得到P值、Q值和轉(zhuǎn)錄本間的差異倍數(shù)（fold-change）；本研究中將兩組進行比較，進行差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05和Fold change＞1.5倍及＜0.66667倍。

五、GO功能類別及通路富集分析

GO數(shù)據(jù)庫（gene ontology）用樹狀分層的方式對基因及蛋白功能進行詳細描述，闡明了基因功能之間的層次關(guān)系。并將基因功能分為：分子功能（MF；molecular function）、生物學(xué)過程（BP；biological pathway）和細胞成分（CC；cellular component）3個類別。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因及其編碼產(chǎn)物間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，信號通路分析（Pathway分析）是基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用Fisher精確檢驗和檢驗，將目標基因參與的通路進行統(tǒng)計學(xué)分析，按照P＜0.05進行篩選，篩選出顯著性差異的信號通路。

六、定量PCR驗證

將測序的RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過對測序結(jié)果中代表性的差異表達基因（GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）進行定量PCR驗證，通過驗證發(fā)現(xiàn)4個基因進行定量PCR驗證，定量PCR使用SYBR Premix ExTaq進行分析，目的基因的mRNA表達量均以β-actin作為內(nèi)參，用2-△△Ct最小二乘法進行計算。每個樣本重復(fù)3個復(fù)孔，每次實驗均重復(fù)3次以上，以保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad 7.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RNA-seq聚類分析結(jié)果

由基因火山圖（圖1）可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，通過對兩個處理組進行比較，得到26573個基因無差異化表達，688個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因414個，下調(diào)表達基因274個。圖中橫坐標表示基因在兩組中的表達倍數(shù)變化值（log2Fold-Change值），縱坐標表示基因在兩組中表達差異的顯著性水平(-log10padj)，數(shù)值越大，差異性越明顯。

圖1 基因火山圖

二、差異基因顯著富集的GO分析結(jié)果

根據(jù)分析結(jié)果中差異基因的顯著性水平構(gòu)建分布圖（圖2），可見在分子功能（BP）、生物學(xué)過程（CC）和細胞成分（MF）3個類別基因中，顯著改變功能基因主要富集于：細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)及細胞外成分、血管新生；細胞遷移及運動的正調(diào)控脈管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)；膠原代謝過程、低氧反應(yīng)、細胞-基質(zhì)粘附；上皮細胞增殖遷移、傷口愈合等。

圖2 GO富集分析柱狀圖

三、差異表達基因的通路顯著性富集分析結(jié)果

由圖3可見，通過KEGG數(shù)據(jù)庫分析，上調(diào)基因明顯富集于細胞外基質(zhì)相關(guān)及細胞增殖、凋亡、遷移的信號通路：黏著斑（Focal adhesion）通路、細胞外基質(zhì)受體相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信號通路、Wnt信號通路、Ras信號通路等，此外還與趨化因子信號通路、補體途經(jīng)（Complement and coagulation cascades）、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)，說明雄激素刺激成纖維細胞后可導(dǎo)致細胞外基質(zhì)信號及炎癥信號通路發(fā)生改變。

圖3 KEGG富集分析柱狀圖

四、定量PCR驗證結(jié)果

由圖4可見，通過對測序結(jié)果中代表性的差異表達基因 （GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）進行定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)4個基因的表達趨勢與測序結(jié)果完全一致，睪酮處理成纖維細胞后能顯著抑制GJA1和JUN基因的表達，顯著增強SMAD3和KRT18基因的表達，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各基因qPCR驗證表達散點圖

討 論

泌尿系統(tǒng)組織、器官纖維化，尤其是尿道狹窄纖維疤痕化的臨床基礎(chǔ)研究較為熱門，但其病理機制研究仍相對薄弱，基于目前的研究，多數(shù)學(xué)者認為其主要病理機制為成纖維細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)之間相互作用，并通過多種細胞因子以及趨化因子參與發(fā)揮作用，調(diào)控著成纖維細胞的增殖與代謝，延緩上皮細胞的修復(fù)重建，影響細胞外基質(zhì)的形成與降解，最終導(dǎo)致創(chuàng)面過度修復(fù)，產(chǎn)生增生性瘢痕，進而破壞原組織完整性，造成疤痕的形成[5]。目前針對該種疾病的研究暫無特定的對應(yīng)細胞系，多數(shù)研究者均采用臨床獲取的尿道等疤痕組織分離純化的成纖維細胞原代培養(yǎng)后進行基礎(chǔ)實驗，缺乏一定的可重復(fù)性的實驗原則，鑒于上述考量，結(jié)合目前研究報道情況，選用靠近尿道組織的較為成熟的人包皮成纖維細胞系（HFF-1）作為實驗對象[6]。

睪酮是雄性動物體內(nèi)最主要的雄性激素。多項研究證實睪酮對血管活性物質(zhì)、炎癥因子等均有不同程度的影響。Foresta等[3]研究證實睪酮可通過雄激素受體途徑促進骨髓內(nèi)皮祖細胞的遷移與增殖，進而減少動脈硬化疾病的發(fā)展。另有報道睪酮可以通過ERK1/2通路影響心肌成纖維細胞的膠原合成和增殖過程[7]。最新的研究顯示在前列腺腫瘤領(lǐng)域內(nèi)，腫瘤相關(guān)成纖維細胞通過胞膜雄激素受體途徑調(diào)控分泌干擾素等細胞因子參與并影響周圍腫瘤干細胞活性[8]。在一項回顧性研究中，從1200例接受尿道成形術(shù)的患者選取11例典型病例，將他們分為正常雄激素組和低雄激素組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組中低雄組患者術(shù)中取得的尿道狹窄疤痕組織的雄激素受體更低，而尿道萎縮壞死率更高，這可能與組織血管化程度低下、缺氧程度高有一定的關(guān)系[9]。雖雄激素及其受體在男科領(lǐng)域研究較為普及，多數(shù)應(yīng)用于前列腺增生及前列腺腫瘤的治療方案上，但其在泌尿生殖器官纖維化領(lǐng)域，尤其是男性尿道狹窄疤痕形成，海綿體纖維化，陰莖硬結(jié)癥等方面機制機理研究目前仍較少涉及。

RNA高通量測序技術(shù)又稱為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過高通量測序手段檢測細胞內(nèi)mRNA水平[10]。測序的流程大致為提取總RNA，根據(jù)不同的樣本進行RNA片段化，再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后通過接頭連接和PCR擴增進行高通量的測序，通過評估得出基因組的表達豐度，并進行差異基因表達分析，通過生信軟件GO分析和KEGG分析進行差異基因分門分類，得出相關(guān)信號通路。目前該項技術(shù)已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究，尤其在腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-12]。

我們的研究通過RNA測序技術(shù)檢測了雄激素對HFF-1細胞引起的基因表達改變的影響，根據(jù)RNA-seq結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雄激素處理后能夠顯著降低相關(guān)纖維化保護性基因的表達，上調(diào)細胞外基質(zhì)相關(guān)及細胞增殖炎癥基因表達，改變細胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)分布，調(diào)節(jié)成纖維細胞遷移能力及其分泌膠原蛋白的細胞功能。在本實驗生信分析中發(fā)現(xiàn)雄激素處理后黏著斑（Focal adhesion）通路、細胞外基質(zhì)受體相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信號通路、Wnt信號通路等均發(fā)生明顯變化，這些經(jīng)典通路可能參與了細胞纖維化的整個過程。以GJA1，JUN基因為代表的相關(guān)通路基因在雄激素處理組中表達顯著下降，這可能是纖維化病理過程中細胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)紊亂，細胞凋亡信號失調(diào)的原因之一，說明高雄激素的環(huán)境影響可以打亂正常的修復(fù)過程，進而導(dǎo)致疤痕進展的重要因素。此外，雄激素能夠顯著增加SAMD3，KRT18基因的表達，我們推測這可能是造成成纖維細胞的過度聚集和過度角化病變的潛在原因[13-15]。

本研究結(jié)果對于揭示雄激素的作用機制和作用靶點，以及對成纖維細胞基因表達的影響提供了系統(tǒng)性的實驗基礎(chǔ)，可能為后續(xù)泌尿系統(tǒng)纖維化尤其是尿道形成疤痕病理機制提供一定的理論依據(jù)。在后續(xù)的研究過程中，我們將進一步研究纖維化過程中各個相關(guān)基因通路的相關(guān)性及相互作用，對于該問題的深入分析，有望發(fā)現(xiàn)尿道疤痕形成中的關(guān)鍵問題，為進一步明確尿道狹窄疾病發(fā)生發(fā)展機制，并為后期疾病的預(yù)防工作新思路、新策略打下基礎(chǔ)。