松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌多樣性1)

趙文娜 楊春雪

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

松嫩鹽堿草地是世界三大蘇打草原鹽堿地之一。如今，鹽堿地面積正以每年1.4%的速度擴展，松嫩草地生態系統正逐步走向衰老[1]。隨著菌根技術作為生物技術應用于鹽堿地修復中，探索叢枝菌根(AM)真菌的研究正在廣泛進行。AM真菌是土壤中重要的生物成員之一，是一種可以與植物形成共生結構的功能性微生物[2]。它通過改善土壤結構、調節寄主植物的礦質營養吸收、調節植物的生理生化指標，從而促進寄主植物的生長，并且可以促進寄主植物在水分脅迫、溫度脅迫、鹽堿脅迫、重金屬脅迫生境下的生長[3-8]。對于AM真菌的研究是從20世紀70年代開始的，在AM真菌多樣性方面的研究已開展了大量的工作。目前全球已發現的通過形態學鑒定出的AM真菌種類約為300種[9]，而在分子生物學水平上，DAVISION et al.[10]以NS31-AM1引物區段為主，收集了已發表的所有AM真菌序列，在97%序列相似性水平上確定了356個AM真菌分子種，并以此建立了Maarj AM數據庫。在此數據庫中，王永明[11]選用中國AM真菌多樣性的數據，并補充了近年來已經發表的該數據庫中未涉及的數據，建立了中國AM真菌多樣性的數據庫，共得到了145個分子虛擬種，隸屬于8科12屬。中國地域廣闊，生態環境復雜，決定了我國AM真菌的物種十分豐富的特征，而在鹽漬土中，AM真菌往往群落結構獨特，很可能蘊藏著具有特殊功能尤其是抗逆性強的AM真菌種類[12-14]。

紫花地丁(Violaphilippica)是堇菜科堇菜屬多年生草本。花紫堇色或淡紫色，翌春返青早，在哈爾濱地區4月左右可見花朵，根系發達，綠期長，是早春耐陰型地被植物[15]。目前人們對于紫花地丁的生態適應性及抗逆性的研究也越來越多，除了耐陰性[16]、抗旱性[17]、抗寒性[18]、耐踐踏[19]等，紫花地丁還可以在含鹽量3.6 g/kg的鹽堿土壤環境下正常生長，具有較強的耐鹽堿能力[20]。通過調查發現，松嫩鹽堿草地有紫花地丁的自然分布，但是關于紫花地丁根圍AM真菌多樣性的研究卻鮮有報道，基于其藍紫花色在園林應用中的價值及其自身強抗逆性，本試驗選取生長在松嫩鹽堿草地的野生紫花地丁為試驗材料，采用形態學鑒定法和高通量測序技術相結合的方法，在科學了解紫花地丁根圍AM真菌多樣性的基礎下，更加充分的了解AM真菌形態，以期結合AM真菌在植物抗逆性方面的研究，進一步豐富藍紫色花植物在鹽堿地的應用，此外也為豐富鹽堿地AM真菌資源，進一步探索具有特殊功能的AM真菌提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究樣品于2019年4月在黑龍江省肇東市周邊(松嫩鹽堿草地西南部)草地進行采集(46°2′29″～46°3′58.16″E，125°54′2″～125°54′40″N)。該地區處于半濕潤半干旱中溫帶大陸性季風氣候區，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，降水的季節性變化造成了土壤雨季脫鹽和旱季積鹽交替變化[21]。在該地區隨機選取9塊紫花地丁生長地作為取樣地，在每個取樣地隨機選取10株長勢相似的紫花地丁，去除表層枯草等雜物，在植株根圍向下挖取約10 cm深的紫花地丁[22]，收集其根圍土壤約1.5 kg，然后經“四分法”，每塊樣地分別保留1 kg根際土壤，將9塊樣地的土樣及根系進行編號，帶回實驗室。樣品在實驗室于通風避光處自然風干，過20目篩子去除雜物，分別裝入已編號的密封袋中，于4 ℃密封保存。

1.2 AM真菌孢子的分離及形態學鑒定

從9份樣品中分別隨機選取50 g土壤，通過濕篩傾析-蔗糖離心法[23]從土壤中分離出孢子和部分雜質，用蒸餾水將其分別沖洗于9個培養皿中，在雙管實體解剖鏡下將孢子挑出，分別置于含有蒸餾水的離心管中，用超聲波清洗儀將孢子清洗干凈后，在雙管實體解剖鏡下，挑取單個孢子于載玻片上，滴加乳酸后蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡(OLYMPUS-DSX500)下記錄不同樣品中孢子的顏色、表面紋飾、連孢菌絲、孢子大小、孢壁層數及厚度等特征并拍照。再用Melzer’s試劑染色，觀察孢子的特異性反應并拍照。孢子根據《菌根鑒定手冊》、國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM)官網、波蘭農業大學(http://www.zor.zut.edu.pl/)以及已發表的論文中的AM真菌資源進行種屬鑒定。

1.3 高通量測序

從9份樣品中分別隨機選取50 g土壤，然后將其混合成一個綜合樣品X，從樣品X中稱取50 g土壤，從樣品X中分別稱取約2 g土壤裝入6支1.5 mL離心管中(6個重復)，分別標號ZHDD1、ZHDD2、ZHDD3、ZHDD4、ZHDD5、ZHDD6。將該6支離心管低溫保存交由上海派森諾生物科技有限公司，提取各樣品的總DNA，同時采用Nanodrop對DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。使用AM真菌特異性引物AMV4.5NF(5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’) 和AMDGR(5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’)進行片段擴增(片段長度280 bp)。隨后通過擴增產物磁珠純化回收、擴增回收產物熒光定量(熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader(Bio Tek,FLx800))，采用Illumina MiSeq-PE250對樣本進行雙端測序。測序數據分析首先對高通量測序的原始數據根據序列質量進行初步篩查，對問題樣本進行重測、補測，去除barcode序列，按照QIIME2 Vsearch對樣本的原始數據進行去引物、拼接、質量過濾、去質量、去嵌合體，從而獲得高質量序列，然后在97%相似度水平對高質量序列聚類，形成OTU。最后去除OTU表格中的singletons OTUs(所有樣本中豐度為1的OTU)。

1.4 數據分析

所有數據根據派森諾測序結果，結合Microsoft Excel和派森諾基因云(https://www.genescloud.cn)云圖匯功能進行部分圖形處理、分析和繪制。孢子圖片采用PS 2019進行處理。

2 結果與分析

2.1 紫花地丁根圍AM真菌形態學鑒定及分布

2.1.1 紫花地丁根圍AM真菌形態學鑒定

通過形態鑒定，共得到11屬30種AM真菌(圖1)。分別為球囊霉屬9種：凹坑球囊霉(Glomusmultiforum)、單孢球囊霉(Glomusmonosporum)、多梗球囊霉(Glomusmulticaule)、海得拉巴球囊霉(Glomushyderabadensis)、具皰球囊霉(Glomuspustulatum)、寬柄球囊霉(Glomusmagnicaule)、微叢球囊霉(Glomusmicroaggregatum)、象牙白球囊霉(Glomuseburneum)、長孢球囊霉(Glomusdolichosporum)；硬囊霉屬1種：彎絲硬囊霉(Sclerocystissinuosa)；無梗囊霉屬7種：波狀無梗囊霉(Acaulosporaundulata)、刺無梗囊霉(Acaulosporaspinosa)、多果無梗囊霉(Acaulosporamyriocarpa)、格但無梗囊霉(Acaulosporagedanensis)、孔窩無梗囊霉(Acaulosporafoveata)、疏線無梗囊霉(Acaulosporapaulinae)、雙網無梗囊霉(Acaulosporabireticulata)；雙型囊霉屬2種：詹氏雙型囊霉(Ambisporajimgerdemannii)、薄壁雙型囊霉(Ambisporaleptoticha)；根孢囊霉屬(Rhizophgus)2種：根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)、明根孢囊霉(Rhizophagusclarus)；隔球囊霉屬(Septoglomus)2種：沙荒隔球囊霉(Septoglomusdeserticola)、縮隔球囊霉(Septoglomusconstrictum)；斗管囊霉屬(Funneliformis)1種：摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)；盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)2種：圓齒盾巨孢囊霉(Scutellosporacrenulata)、黑盾巨孢囊霉(Scutellosporanigra)；近明球囊霉屬2種：幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)、近明球囊霉(Claroideoglomusclaroideum)；內養囊霉屬(Entrophospora)1種：波羅的海內養囊霉(Entrophosporabaltica)；巨孢囊霉屬(Gigaspora)1種：易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens)。

圖1 松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌形態鑒定

2.1.2 紫花地丁根圍AM真菌分布

松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍不同采樣地土壤中AM真菌分布如表1所示，不同的AM真菌在不同土樣中的分布是不同的。在紫花地丁根圍土壤中，薄壁雙型囊霉、彎絲硬囊霉、沙荒隔球囊霉、縮隔球囊霉、幼套近明球囊霉、近明球囊霉較為常見。而具皰球囊霉、海得拉巴球囊霉、雙網無梗囊霉、波羅的海內養囊霉分別僅在2、8、7、6號樣品中發現。

表1 松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌分布

續(表1)

2.2 高通量測序數據質量

通過高通量測序，對松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌群落進行了系統性的分析，從紫花地丁根圍土壤中平均獲得有效序列74 718條，高質量序列65 068條，去除所有樣本中豐度為1的OTU平均獲得65 000條序列。共獲得OTU數1 273個(表2)。物種累計曲線用于衡量和預測群落中物種豐富度隨樣本量擴大而增加的幅度，被廣泛應用于判斷樣本量是否足夠并估計群落豐富度[24]。由圖2可知，隨著樣本量的增加，此時群落中的OTU總數將不再隨著新樣本的加入而顯著增加，曲線趨于平緩，表明樣本量已足以反映松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌群落的物種組成。

表2 測序數據質量統計

圖2 紫花地丁根圍AM 真菌物種累積曲線

2.3 高通量測序物種組成

2.3.1 AM真菌屬水平的相對豐度

通過將所得到的OTUs的代表序列與Maarj AM數據庫進行對比，從而對結果進行物種注釋。從屬水平上看(表3)，去除未注釋到屬的結果：未注釋Archaeosporales, 未注釋Gigasporaceae, 未注釋Glomerales, 未注釋Glomeromycetes, 未注釋Glomeromycota。從紫花地丁根圍土壤中共檢測并注釋到球囊霉屬，近明球囊霉屬、類球囊霉屬(Paraglomus)、多樣孢囊霉屬(Diversispora)、無梗囊霉屬、雙型囊霉屬和盾巨孢囊霉屬7個屬。其中球囊霉屬相對豐度最高，平均相對豐度為92%，其次為類球囊霉屬和近明球囊霉屬，其平均相對豐度分別為3%和2%，豐度值最低的為盾巨孢囊霉屬。本研究中球囊霉屬的平均相對豐度遠高于其他6個屬，為松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍AM真菌優勢屬。

表3 紫花地丁根圍AM真菌屬水平相對豐度

2.3.2 AM真菌物種的相對豐度

通過對測序結果進行物種注釋，鑒定到明確物種信息的有103種，分屬于7屬。其中球囊霉屬鑒定出82種，近明球囊霉屬鑒定出10種，類球囊霉屬鑒定出5種，多樣孢囊霉屬鑒定出3種，雙型囊霉屬、盾巨孢囊霉屬，無梗囊霉屬各一種。圖3可以明顯看出，在紫花地丁根圍土壤中Glomussp. VTX00202、Glomussp. VTX00222、Glomussp. VTX00304、Glomussp. VTX00172、Glomussp. VTX00419的豐度水平相對較高，Glomussp.VTX00222和Glomussp. VTX00202在紫花地丁根圍土壤AM真菌群落中所占豐度比例最大，遠高于其他種，其中Glomussp. VTX00222相對豐度為19.2%，為紫花地丁根圍土壤中的AM真菌優勢種。

圖3 紫花地丁根圍AM真菌物種的相對豐度分析

2.3.3 AM真菌的α多樣性指數

α多樣性是指局部均勻生境下的物種豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標。本研究以Chao1指數表征豐富度，以Shannon和Simpson指數表征多樣性，以Pielou’s evenness指數表征均勻度，以Good’s coverage指數表征覆蓋度。紫花地丁根圍AM真菌的Chao1指數在855.317～931.122，Simpson指數在0.959 55～0.965 031，Shannon指數在5.672 41～5.726 42，Pielou’s evenness指數在0.603 710～0.624 549，Good’s coverage指數在0.995 834～0.996 308(表4)。

表4 紫花地丁根圍AM真菌的α多樣性指數

3 結論與討論

本試驗采用形態學鑒定和高通量測序技術結合的方法，對松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍土壤中AM真菌多樣性進行調查分析。通過形態學鑒定共得到11屬30種AM真菌。由于形態學鑒定結果容易丟失不產生孢子的種類，并且部分孢子的形態很相似，很難客觀全面的對AM真菌作出評價[25]。為了提高形態學鑒定結果的科學性，本試驗進一步通過高通量測序技術進行紫花地丁根圍土壤AM真菌多樣性的分析，共發現7屬103種VT，球囊霉屬為該地區紫花地丁根圍土壤AM真菌優勢屬，與形態學鑒定結果一致，其中Glomussp. VTX00222為松嫩鹽堿草地紫花地丁根圍土壤的優勢菌種。將以上研究結果與前人松嫩鹽堿草地研究[26-31]結果進行對比，發現：球囊霉屬均為該地區相關研究的優勢屬，其中，大果球囊霉(Glomusmacrocarpum)、蔭性球囊霉(Glomustenebrosum)、刺球囊霉(Glomusspinosum)、微刺球囊霉(Glomusspinuliferum)、紅色盾巨孢囊霉(Scutellosporaerythropa)5種只在旋覆花根圍發現；何氏球囊霉(Glomushoi)、聚叢根孢囊霉(Rhizophagusaggregatus)、黏質隔球囊霉(Glomusviscosum)、膨脹無梗囊霉(Acaulosporadilatata)、凹坑無梗囊霉(Acaulosporaexcavata)、多產雙型囊霉(Ambisporafecundispora)、盾狀盾巨孢囊霉(Scutellosporascutata)共7種只在星星草根圍發現；Diversisporatortuosa、Funneliformiscoronatus、德里球囊霉(Glomusdelhiense)、加拿大球囊霉(Glomuscanadense)、閃亮和平囊霉(Pacisporascintillans)、透光根孢囊霉(Rhizophagusdiaphanus)、懸鉤子硬囊霉(Sclerocystisrubiformis)、異配齒盾囊霉(Dentiscutataheterogama)、疣突斗管囊霉(Funneliformisverruculosum)9種僅在馬藺根圍發現；黃孢球囊霉(Glomusflavisporum)、團集球囊霉(Glomusglomerulatum)、暈環球囊霉(Glomushalonatum)、Acaulosporasporocapia、Septoglomusconstrictum共5種僅在鵝絨委陵菜根圍發現，然而，多梗球囊霉、象牙白球囊霉、波狀無梗囊霉、多果無梗囊霉、疏線無梗囊霉5種首次在該地區紫花地丁根圍AM真菌研究中被發現。此外，在該地區26種植物(包括旋覆花、星星草、馬藺、蒲公英、鵝絨委陵菜)研究中，縮隔球囊霉、根內根孢囊霉兩種在該6個研究中均被發現，摩西斗管囊霉、凹坑球囊霉、膨果球囊霉(Glomuspansihalos)、沃克近明球囊霉(Claroideoglomuswalkeri)、長孢球囊霉、光壁無梗囊霉(Acaulosporalaevis)、孔窩無梗囊霉、薄壁雙型囊霉、彎絲硬囊霉、明根孢囊霉10種在大多數植物根圍被發現。造成該部分差異的原因分析：植物物種多樣性、基因型多樣性、功能群多樣性等都對AM真菌多樣性有一定的影響[32]。分析兩種鑒定方法，形態學鑒定具有不一致性、局限性和偶然性[33]，并且要求鑒定者對于已發現的AM真菌形態熟悉程度較高，因此，采用此方法很可能會低估該地區AM真菌多樣性。而高通量測序技術相對形態學鑒定方法具有較高的準確性，但其也存在一定的局限性，采用高通量測序技術，由于微生物種類繁多，而目前的數據庫中微生物序列還無法完全覆蓋測序序列，或是參考序列缺少準確的物種信息，導致一些具體的種、屬之間無法鑒別分開，從而導致一部分特征序列無法獲得種屬注釋，并且在分析過程中，一些豐度值非常低的種類可能被遺漏掉。通過將兩種方法結合起來，可以幫助更全面的發現AM真菌，從而提高試驗的科學性和準確性。

鹽堿地是一類特殊的土地資源，而在此類特殊生境內，可能蘊藏著具有特殊功能的AM真菌。早在2002年，王發園等[34]對黃河三角洲鹽堿地AM真菌多樣性進行研究，共獲得32種AM真菌，分屬于無梗囊霉屬、原囊霉屬(Archaeospora)、球囊霉屬，后在2016年王艷云等[35]對黃河三角洲鹽堿地AM真菌多樣性的調查中，又發現了類球囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、多樣孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬6屬AM真菌的存在，其中球囊霉屬為黃河三角洲鹽堿地AM真菌優勢屬。在甘肅、寧夏、內蒙古鹽堿土AM真菌研究中，共得到球囊霉屬20種，多樣孢囊霉屬2種，原囊霉屬2種，無梗囊霉屬4種，其中根內根孢囊霉和薄壁雙型囊霉為該地區鹽堿土中AM真菌優勢種。而遠觀全球鹽堿土中AM真菌多樣性研究發現，球囊霉屬、巨孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬、無梗囊霉屬、內養囊霉屬、根孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、多樣孢囊霉屬、硬囊霉屬在鹽堿土中均被檢測到,這與本研究結果表現一致，而在其中優勢種的分析中，各個地區研究的結果是不同的，但大都屬于球囊霉屬，也有部分研究中的優勢AM真菌種屬于根孢囊霉屬、無梗囊霉屬[36-38]。因此我們可以思考球囊霉屬、類球囊霉屬、近明球囊霉屬、多樣孢囊霉屬、無梗囊霉屬、雙型囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、斗管囊霉屬、近明球囊霉屬等在鹽堿地常被檢測到的AM真菌屬是否對于鹽堿生境有著不同程度的適應性，尤其是球囊霉屬在鹽堿生境中的重要地位，這也是我們需要進一步探索的問題。此外，因AM真菌受寄主植物的影響，一些AM真菌物種主要在深層土中形成孢子，而一些常在表土層形成孢子[39]。由于不同植物根系生長范圍不同，我們需研究不同植物根圍土壤AM真菌種類，發現更多AM真菌，豐富鹽堿地AM真菌資源，為進一步發現耐鹽性AM真菌種類提供一定的理論基礎。