脂肪間充質干細胞分泌蛋白對小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝部分切除肝細胞自噬損傷的影響

馬亞軍，劉笑凝，焦智慧，樸晨曦，徐嘉元，張千振，王洪斌 (東北農業大學 動物醫學學院 黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是一種病理生理應激狀態，指肝臟的血液供應被中斷，一定時間后重新恢復血供所引起的損傷。肝IRI對肝臟和全身性的影響在肝移植臨床應用中具有重要意義[1]。肝IRI發生后，肝臟細胞內多種細胞因子分泌發生紊亂，活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)大量產生，從而加重肝臟損傷。自噬是一種高度保守的生物過程，其通過清除降解受損細胞器和蛋白質并進一步轉化為能量來維持細胞穩態和活力[2]。肝臟在病理和生理學方面很大程度上依賴于自噬。自噬通常被認為是一種細胞內的自我保護機制，然而過度自噬卻會導致細胞死亡[3-4]。在極端情況下，過度的自噬會導致自噬空泡的積累，從而使細胞死亡。肝臟缺血后，細胞內ATP過度消耗、生成不足，AMPK活化，mTOR被抑制，自噬發生。此時自噬能夠幫助機體迅速適應乏氧及營養不足的環境。再灌注時，氧化應激增強，ROS介導自噬過程中的多種信號傳導導致自噬進一步增強，進而誘導自噬性細胞死亡。PI3K/AKT通路在控制細胞生長、增殖、存活和代謝中起著重要作用，mTOR是細胞內自噬的主要抑制因子，其哺乳動物靶點受PI3K/AKT通路的正調控[5]。

隨著干細胞治療技術的深入研究，再生醫學治療尋求將非愈合性損傷引導至組織結構和功能的完全恢復。干細胞再生療法最初的假設是基于干細胞分化功能，但有研究發現，干細胞的治療潛力可能不只是單獨來自于細胞分化和替代功能，還可能取決干細胞的旁分泌作用[6-7]。干細胞受其局部微環境、周圍細胞和干細胞的分泌物共同作用影響[8-9]，通過分泌一系列營養因子，如細胞因子、生長因子和趨化因子進入微環境中，進而控制細胞增殖、遷移和分化，并提供細胞保護[10-11]。本研究通過觀察肝IRI合并肝部分切除術術后3，7 d肝細胞自噬水平變化，探究脂肪間充質干細胞分泌蛋白(adipose-derived mesenchymal stem cells-secretome,ADSCs-secretome)對于肝IRI合并肝部分切除肝細胞過度自噬損傷的修復作用，為進一步無細胞產品代替細胞療法應用到臨床提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4～6月齡廣西巴馬小型豬24頭，體質量20～30 kg，在同等條件下進行飼養，且臨床及試驗檢查健康。隨機分為4組：IRI組+saline對照組(IRI組)、IRI+DMEM對照組(DMEM組)、IRI+ADSCs-secretome干預組(ADSCs-sec組)、IRI+ADSCs干預組(ADSCs組)，每組6頭，雌雄各半。

1.2 主要試劑與儀器腹腔鏡、氣腹機(日本Olympus公司)，冷光源、高清內窺鏡攝像系統(深圳市神州醫療設備有限公司)，腹腔鏡手術器械(日本Olympus公司)實時熒光定量 PCR 儀(上海羅氏制藥有限公司)，電泳轉印系統(美國 Bio-Rad 公司)，二氧化碳培養箱(德國 Eppendorf 公司)。

注射用丙泊酚(西安力邦制藥有限公司)，小型豬復合麻醉劑(東北農業大學獸醫外科教研室研制)，異氟烷(河北一品制藥有限公司)，多聚甲醛試劑(武漢博士得生物有限公司)，胎牛血清(美國 CLARK 公司)，DMEM 低糖培養基(美國 Invitrogen 生命技術有限公司)，Beclin1、LC3Ⅱ、P62 抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)，p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)。

1.3 小型豬ADSCs的體外分離培養在無菌條件下取豬脂肪組織，PBS洗滌、去筋膜、剪碎，與等體積的0.1% Ⅰ型膠原酶混合，37℃搖床中進行酶消化45 min，終止消化，過濾，1 500 r/min離心10 min。棄上清，向沉淀中加入紅細胞裂解液，充分裂解5 min 除去紅細胞,1 500 r/min離心5 min得到最終的細胞沉淀，培養液(DMEM，10% FBS，1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺)重懸，吹勻，接種到培養瓶中，于37℃、5% CO2中進行培養。細胞約2 d完成貼壁。本試驗使用P4代細胞。

1.4 ADSCs-secretome的制備ADSCs培養至P4代，待細胞全部鋪滿，棄去瓶中培養液，PBS清洗，換成無血清培養液進行饑餓培養。48 h后提取瓶中培養上清液。將提取的上清液1 500 r/min離心10 min，去除上清液中殘留的死細胞和細胞碎片。然后使用無菌過濾器進行過濾，最后在無菌條件下放入3 KD超濾濃縮管中，5 000 r/min離心1 h進行濃縮，濃縮比例約為24∶1，濃縮后的上清液-80℃ 保存備用。

1.5 建立手術模型進行動物保定，肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)，耳緣靜脈注射丙泊酚、小型豬復合麻醉劑(0.02 mg/kg)。確認麻醉后，進行氣管插管并連接呼吸麻醉機，進一步維持麻醉。調適手術臺溫度在37℃左右。麻醉過程中，異氟烷濃度為2.5%～4%，氧流量0.8～1 L/min，呼吸頻率15～20次/min，潮氣量10～15 mL/kg，呼吸比1∶2，術中通過靜脈通路注射生理鹽水。

消毒手術部位，在小型豬腹部相應位置插入套管(10 mm內徑套管、5 mm內徑套管各2個)(圖1)。使用腹腔鏡器械，首先游離肝臟右葉根部膽囊管，使用止血帶穿過膽囊游離處，再從肝臟右葉基部兩側肝實質處穿過，環住整個肝臟右葉。收緊止血帶，進行肝臟右葉缺血處理，60 min后，松開止血帶，恢復右肝血供。采用三排縫合法對肝臟左葉進行結扎。結扎完成后，切除肝臟左葉，檢查肝臟斷面出血情況，進行止血處理。術后即刻，采用分點注射法向肝實質注射相同劑量的相應干預物。IRI組注射生理鹽水，DMEM組注射DMEM濃縮液，ADSCs組注射ADSCs重懸液，ADSCs-sec組注射ADSCs-secretome濃縮液。最后取出離斷肝臟組織，關閉氣腹，排出腹腔內氣體，縫合外部創口。

A、B.10 mm內徑套管；C、D.5 mm內徑套管圖1 建立手術通路

于術前、術后3，7 d應用腹腔鏡技術進行組織樣本采集，于液氮中迅速冷凍后，-80℃保存，采集的組織樣本主要用于基因、蛋白檢測。

1.6 RT-qPCR檢測向組織樣本中加入TRIzol進行研磨、裂解、試劑處理、離心、水浴提取總RNA,應用超微量核酸檢測儀檢測RNA濃度與純度，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，最后進行實時熒光定量PCR反應。引物設計與合成見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 Western blot檢測在肝組織樣本中加入裂解液經研磨、裂解、離心提取樣本總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，使用Buffer(5×)進行樣本處理，經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光檢測樣本目的蛋白含量。

1.8 免疫組化肝組織樣本經固定、包埋、切片制成切片。處理好的切片依次進行脫蠟、阻斷、抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、封片，最終在光學顯微鏡下觀察染色情況，獲取圖片，并進行圖片分析。

2 結果

2.1 ADSCs-secretome對肝臟自噬相關基因的影響如圖2所示，與術前相比，術后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達量均呈極顯著性上升(P<0.01)，p62 mRNA表達量呈極顯著性下降(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達量基本恢復至正常水平(P>0.05)，p62 mRNA 呈顯著性下降(P<0.05)；術后7 d，各分組中的Beclin-1、ATG5、ATG12、p62 mRNA表達水平已全部恢復至術前水平(P>0.05)。結果顯示，術后3 d，DMEM組與IRI組相比，Beclin1、ATG5、ATG12、p62 mRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，Beclin1、ATG5、ATG12 mRNA表達水平明顯降低，p62 mRNA表達量明顯升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，各自噬相關基因指標結果無顯著性差異。術后7 d，4個分組數據顯示已無顯著性差異(P>0.05)。

A～D.分別為Beclin-1、ATG5、ATG12、p62在肝組織中的mRNA表達量變化；▲▲P <0.01，▲P < 0.05，與術前相比；##P < 0.01，與DMEM組相比圖2 自噬相關基因表達情況

2.2 ADSCs-secretome對肝臟自噬相關蛋白的影響如圖3所示，術后3 d，DMEM組與IRI組相比，Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達量差異不顯著(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達水平呈極顯著性降低(P<0.01)，p62蛋白表達水平呈極顯著性上升(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05)。術后7 d，各組之間各自噬相關蛋白表達量差異不顯著(P>0.05)。

A.自噬相關蛋白圖；B～D.分別為Beclin-1、LC3Ⅱ、p62在肝組織中的蛋白表達量變化；##P<0.01，與DMEM組相比圖3 自噬相關蛋白表達量

2.3 ADSCs-secretome對肝臟自噬相關蛋白LC3Ⅱ影響的免疫組化結果如圖4，5所示，術后3 d，DMEM組與IRI組相比，LC3Ⅱ蛋白表達量無明顯差異(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，LC3Ⅱ蛋白表達量呈極顯著性降低(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，兩者無顯著性差異(P>0.05)。術后7 d，4組之間LC3Ⅱ蛋白表達量已無顯著性差異(P>0.05)。

##P < 0.01，與DMEM組相比圖5 LC3Ⅱ蛋白表達情況

2.4 ADSCs-secretome對肝臟自噬通路PI3K/Akt/mTOR相關基因的影響由圖6可見，術前，各組PI3K、Akt、mTOR基因表達量較高。相比于術前，術后3 d，ADSCs組與ADSCs-sec組PI3K、Akt、mTOR mRNA已基本接近術前水平(P>0.05)，IRI組和DMEM組仍未恢復(P<0.01)；術后7 d，各組中PI3K、Akt、mTOR mRNA全部恢復至術前水平(P>0.05)。其中，結果顯示，術后3 d，DMEM組與IRI組之間無顯著性差別(P>0.05)；ADSCs-sec組PI3K、Akt、mTOR mRNA表達量顯著高于DMEM組(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs結果無顯著性差異(P>0.05)。術后7 d，各組之間已無顯著性差異(P>0.05)。

A～C.分別為PI3K、Akt、mTOR在肝組織中的mRNA表達量變化；▲▲P<0.01，與術前相比；##P<0.01，與DMEM組相比圖6 自噬通路相關基因表達情況

2.5 ADSCs-secretome對肝臟自噬通路PI3K/Akt/mTOR相關蛋白的影響如圖7所示，術后3 d，DMEM組與IRI組中的p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值無顯著性差異(P>0.05)；ADSCs-sec組中的p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值顯著高于DMEM組(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組之間無顯著性差異(P>0.05)。術后7 d，各組之間p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 ADSCs-secretome對肝細胞自噬損傷后期修復的調節作用肝IRI是一種嚴重的并發癥，發生在低血容量休克、肝切除和肝移植過程中，會對患者的預后產生不利影響[12]。自噬在維持肝細胞內環境穩定方面起著重要作用。當細胞受到損傷時，自噬發生為細胞提供能量，旨在降低損傷程度，防止細胞死亡。然而，重度IRI卻會導致自噬過度增強，過度的自噬會破壞細胞內正常的蛋白質和細胞器，從而導致細胞損傷加重，甚至死亡。多項研究發現，降低肝IRI術后過度自噬反應能夠改善肝損傷，促進肝臟修復[13-14]。有研究表明，肝IRI合并肝切除能夠引起肝細胞過度自噬，進而加重了肝損傷[3-4]。然而，目前關于自噬的研究大多針對于肝IRI 24 h內的自噬變化進行觀察檢測，對于肝IRI細胞自噬后期變化知之甚少。針對這一問題，本試驗對肝IRI術后3，7 d的樣本進行提取、檢測。結果顯示，肝IRI術后3 d時，自噬表達仍處于較高水平，術后7 d，自噬水平恢復正常。因具有易獲得肝細胞分化潛力以及旁分泌效應等優勢，ADSCs已成為一種很有前途的缺血性肝臟疾病治療細胞。目前，有研究表明，基于ADSCs治療的組織修復主要歸因于其旁分泌效應，包括抗凋亡、促血管生成、抗炎作用和抑制纖維化[15-16]，而不是直接其分化作用。LEE等[17]研究發現ADSCs-secretome能夠減輕肝損傷，改善肝IRI后的肝臟微環境。此外，GE等[4]研究結果顯示，ADSCs移植能夠通過降低肝細胞過度自噬水平進而減輕肝IRI造成的肝損傷。為進一步探究了ADSCs旁分泌作用在肝IRI肝細胞過度自噬損傷修復中的調節作用，本試驗對自噬相關因子Beclin-1、ATG5、ATG12、LC3Ⅱ、p62進行了檢測，觀察ADSCs-secretome干預后，肝細胞自噬反應的變化。結果顯示，與術前相比，術后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達量均表現為顯著性升高，p62 mRNA表現為顯著性降低，以上結果表明，術后3 d時，肝IRI合并肝切除肝細胞過度自噬損傷仍未恢復。術后3，7 d，DMEM組與IRI組結果顯示均無明顯差異，結果表明，DMEM對肝IRI合并肝切除引起的肝細胞過度自噬損傷后期無調節作用，與生理鹽水無差別。術后3 d，ADSCs-sec組與DMEM組相比，肝細胞過度自噬損傷明顯得到緩解，ADSCs-sec組在術后3 d時，各自噬相關基因指標已基本恢復至術前水平，以上結果表明，ADSCs-secretome能夠加快肝IRI合并肝部分切除引起的肝細胞過度自噬損傷修復。

3.2 ADSCs-secretome對肝細胞自噬損傷后期修復的調節機制研究表明，PI3K/Akt/mTOR 信號通路對細胞自噬和凋亡均具有調節作用[18-20]。mTOR是哺乳動物細胞中雷帕霉素的分子靶標，是調節細胞生長與代謝的重要因子，mTOR的活化可抑制自噬的表達。磷酸化的Akt可激活mTOR，mTOR則會抑制下游分子ULK1復合物從而負調節自噬反應。結果顯示，與術前相比，術后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的PI3K、Akt、mTOR mRNA表達量均呈顯著性降低，自噬通路PI3K/Akt/mTOR受抑制。DMEM組與IRI組在術后3，7 d，PI3K/Akt/mTOR相關指標檢測結果顯示無顯著差異，因此，DMEM對術后PI3K/Akt/mTOR通路無調節作用。術后3 d，與DMEM組相比，ADSCs-sec組中的PI3K、Akt、mTOR mRNA及p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白比值均呈顯著性升高，且與術前相比，術后3 d，ADSCs-sec組中的PI3K/Akt/mTOR相關基因結果顯示已無顯著性差別。結合以上自噬相關結果分析得出，ADSCs-secretome可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路從而促進肝IRI合并肝部分切除引起的肝細胞過度自噬損傷修復。

本試驗結果表明，肝IRI合并肝切除術后3 d時，肝細胞過度自噬仍未恢復，而ADSCs-secretome能夠加快肝IRI合并肝部分切除引起的肝細胞過度自噬損傷修復，且其修復機制可能是通過激活自噬負調控通路PI3K/Akt/mTOR進行調節的。