抗登革病毒人源化單克隆抗體h1A1D的構建及純化

劉宇夢，汪 偉，孫世宇，于 寧，李成輝，莊忻雨，孫文超，魯會軍*，金寧一* (1.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧530001；.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春1301；3.延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133000；4.溫州大學 病毒學研究所，浙江 溫州 35035)

登革病毒(dengue virus，DENV)是一種重要的蚊媒傳染病病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，主要的傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊[1]，DENV感染可引起不同程度的臨床癥狀，從無感染癥狀到有嚴重的登革出血熱和登革休克綜合征，并可能導致死亡[2-3],死亡率高達10%[4]。登革熱已成為一個全球性的嚴重公共衛(wèi)生問題[5-6]。

DENV有4種血清型(DENV1～DENV4)，每種血清型中又有多個基因型[7]，主要以DENV2型流行[8- 9]。DENV為單股正鏈RNA病毒，含有1個開放閱讀框，編碼3種結構蛋白(C、pr M和E)和7種非結構蛋白[10]。有研究表明，DENV自然感染過程中誘導的抗體明顯以包膜(E)和膜前(pr M)蛋白為靶點[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，DENV單克隆抗體h1A1D 能識別ED Ⅲ上的表位，且對4種血清型具有中和活性[13-15]。鼠源性抗體作為異源蛋白應用于人體會引起針對異源蛋白的免疫排斥反應，誘發(fā)產(chǎn)生人抗鼠抗體，縮短了抗體在體內(nèi)的半衰期影響了抗體的治療效果引起人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)反應[16-17]。人源化單克隆抗體已經(jīng)成為治療性抗體藥物研究的重要方向，因此，需研發(fā)一種具有廣譜抗DENV中和活性的單克隆抗體。

本研究參考 GenBank公布的抗體序列，通過基因工程技術將DENV鼠源單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人源抗體輕重鏈恒定區(qū)氨基酸序列合成至pcDNA 3.1(+)載體上，轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞進行抗體表達，Protein A親和純化后，成功制備了抗DENV人源化單克隆抗體h1A1D，本研究結果對進一步探索DENV致病機制及研發(fā)登革熱的抗體藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器倉鼠卵巢細胞CHO-K1細胞購自中國科學院細胞庫；限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DL5000 DNA Marker均購自Sigma公司；F-12培養(yǎng)基購自Gibco公司；Protein A親和純化介質(zhì)購自美國GE公司；凝膠成像系統(tǒng)購自PROTEINSIPMLE公司。

1.2 人源化抗體的構建DENV鼠源單克隆抗體m1A1D輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列來自 PDB 數(shù)據(jù)庫，PDB：2R69L，2R69H。人源抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)氨基酸序列根據(jù)NCBI上已發(fā)表的序列(GenBank登錄號：MN200291.1，AY623427.1)。按照圖1所設計的抗體結構合成人源化抗體h1A1D基因序列。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 人源化抗體設計圖

1.3 人源化抗體h1A1D的真核表達載體的構建將DENV鼠源單克隆抗體m1A1D重鏈和輕鏈可變區(qū)和人源抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)合成連接后，再合成至pcDNA3.1(+)載體上。最后得到h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL質(zhì)粒，克隆至含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h；提取重鏈和輕鏈表達載體質(zhì)粒。用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切進行酶切鑒定，酶切鑒定正確后，用質(zhì)粒大量提取試劑盒提取輕重鏈質(zhì)粒后，用微量分光光度計測定其質(zhì)量濃度，-40℃ 保存。

1.4 人源化單克隆抗體的表達及純化

1.4.1人源化單克隆的轉(zhuǎn)染及壓力篩選 將1×106CHO-K1細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分別將抗體的重鏈和輕鏈表達質(zhì)粒各1 μg和2 μL 轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，離心收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測抗體是否表達，確定表達后，陽性孔細胞更換含14 g/L G418的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。

1.4.2抗體的純化 將具有抗性克隆的培養(yǎng)基，離心取上清，用0.22 μm膜過濾，柱平衡：用10倍體積的PBS( pH 7.5 )清洗Protein A柱。上樣：將樣品加入上樣至柱床，收集液體(此液體簡稱流穿液)。抗體洗脫：輕輕在柱床上加入洗脫液(20 mm檸檬酸pH 2.7緩沖液)；用中和液(1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0)中和，承接時宜多管順次接取，并記錄順序。洗脫完畢后，用PBS平衡柱子。抗體用PBS(pH 7.2)透析3次，每次4 h以上。透析結束后用0.22 μm膜過濾，分裝，-80℃保存。透析后的樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳分析h1A1D抗體的相對分子質(zhì)量大小和純度分析。

1.5 SDS-PAGE蛋白電泳及染色蛋白樣品制備：取純化的洗脫液以及純化后的抗體，加入蛋白上樣緩沖液，還原電泳的樣品置于沸水浴10 min；SDS-PAGE蛋白電泳后，考馬斯亮藍快速染色液染色，脫色，完成脫色后觀察結果。

1.6 Western blot分析結合活性Western blot分析h1A1D抗體的結合活性，用本實驗室構建含有4種血清型DENV ED3蛋白串聯(lián)基因的4D蛋白Western blot檢測其結合活性，以h1A1D 抗體測定其結合。

2 結果

2.1 單抗輕、重鏈質(zhì)粒的鑒定對合成的h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，獲得的重、輕鏈抗體大小分別約為1 800，900 bp，與預期大小一致(圖2)。

M.DL5000 DNA Marker；1.h1A1D重鏈完整基因片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)；2.h1A1D輕鏈基因片段(Hind Ⅲ/EcoRⅠ ) 和pcDNA3.1(+)載體片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)圖2 h1A1D- pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的 Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定結果

2.2 抗體的純化和表達鑒定將輕、重鏈表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，經(jīng) G418 壓力篩選，獲得穩(wěn)定表達人源化h1A1D抗體的細胞系，擴大培養(yǎng)后，進行Protein A 親和抗體純化，收集洗脫液進行SDS-PAGE 檢測，結果如圖3A所示，目的抗體蛋白得到了有效的濃縮和純化；將純化后得到的h1A1D抗體分別利用還原膠和非還原膠進行SDS-PAGE電泳分析h1A1D抗體的相對分子質(zhì)量大小。如圖3B、C所示，h1A1D二價抗體的輕、重鏈大小分別為 30，55 kDa，完整抗體約 190 kDa，與預期大小一致。純化后抗體的蛋白質(zhì)量濃度均為1.42 g/L。

A，C.非還原膠SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析；B.還原膠SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析 MW.蛋白 Marker；IN.細胞培養(yǎng)上清；FT.流出液；W.洗脫液；E.洗脫部分圖3 Anti-h1A1D純化結果

2.3 抗體的純化和表達鑒定首先，抗體含有4種血清型DENV ED3蛋白串聯(lián)基因的4D蛋白進行Western blot分析，結果顯示，1A1D能特異結合抗原(圖4)，說明本研究構建的人源化嵌合抗體h1A1D具備了結合活性。

M.蛋白Marker;1.細胞培養(yǎng)上清；2.含有4種血清型的4D蛋白圖4 h1A1D抗體特異結合檢測

3 討論

目前DENV感染率和病死率仍在不斷增加[16]，每年全球約有4億人感染DENV，其中約有1億人出現(xiàn)不同程度的癥狀[18]。由于尚未發(fā)現(xiàn)能夠用于臨床的針對登革熱感染的抗病毒藥物，對于該傳染病的治療僅僅是對癥治療。有文獻報道針對DENV的特異性抗體的研制已經(jīng)持續(xù)了40 多年，從 20世紀 80 年代開始的鼠源抗體到現(xiàn)在的全人源單克隆抗體[19]，DENV的中和抗體需要足夠高效，且最好能同時中和4種血清型的病毒[20]。本研究的目的是為后期獲得廣譜、高效且特異性好的DENV抗體奠定基礎。

目前DENV在同一地區(qū)存在不同血清型的交叉感染，因此需要能同時有效中和4種血清型的抗體[21]。而單克隆抗體 1A1D 識別 EDⅢ上的表位，通過抑制病毒同細胞表面受體的結合而預防感染，對 DENV1-3都具有中和保護活性。因此本試驗所設計的h1A1D單克隆抗體目的在于通過基因工程技術來對人源的單克隆抗體和鼠源的單克隆抗體進行改造，獲得人源化的單克隆抗體，Western blot結果顯示，h1A1D能特異結合抗原，說明本研究構建的人源化嵌合抗體h1A1D具備了結合活性。

本試驗選擇pcDNA3.1真核表達載體構建h1A1D-pcDNA3.1(+)重組表達載體，這與原核表達載體相比，雖然不能一次性獲得大量的蛋白，但是真核細胞中表達蛋白具有高活性。本研究旨在獲得純化的h1A1D，采用protein A親和層析純化方法，此操作簡單、簡易、有效，整個純化過程操作時間短，較高程度的降低了蛋白降解的可能性，較好的保持了蛋白本身的活性。

本研究將登革鼠源抗體h1A1D重、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人源抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列合成到pcDNA3.1(+)真核表達載體，轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞進行抗體表達，親和純化后，成功制備了抗DENV人源化單克隆抗體h1A1D。