前列腺素D2對大腸桿菌誘導的小鼠巨噬細胞細胞因子分泌的影響

金 鳳，李茜如，鞏志國，顧柏臣，趙佳敏，曹金山，劉 博 (內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

前列腺素(PGs)的形成過程為花生四烯酸(AA)在環氧合酶(COXs)，包括COX-1和COX-2的作用下轉化為前列腺素H2(PGH2)，隨后在前列腺素合成酶(prostaglandin synthetase)的作用下轉化為PGs[1]。與炎癥反應調控過程關聯最緊密的PGs包括前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)[2]。在炎癥反應中，PGE2可視為一種典型的炎癥介質[3-6]。在此過程中，PGD2的分泌水平同樣出現顯著上升[7]。在小鼠巨噬細胞中，PGD2的合成分泌與其合成酶的表達呈正相關，主要通過造血型前列腺素D2合成酶(H-PGDS)依賴性途徑產生[2,7-8]。PGD2是否能夠調控病原菌感染后免疫細胞細胞因子的分泌，尚需進一步的探討。

巨噬細胞可通過分泌細胞因子對病原微生物及其病原相關分子模式(PAMPs)所激活的天然免疫應答起到關鍵調節作用[9]。在小鼠巨噬細胞被金黃色葡萄球菌感染后，其PGE2的合成分泌依賴于細胞中TLR2(TLR2)、TLR4(TLR4)和NLRP3(NLRP3)等模式識別受體(PRRs)的存在[10]。此外，大腸桿菌感染可誘導小鼠巨噬細胞中PGs的合成分泌[11]。因此，在巨噬細胞中，PGs的合成分泌與細菌感染之間具有緊密的關聯，但大腸桿菌感染巨噬細胞后通過何種模式識別受體誘導PGD2的合成分泌，目前尚不清楚。

本研究探討了模式識別受體TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌誘導巨噬細胞PGD2合成分泌中的作用。此外，分析了內源性和外源性PGD2對大腸桿菌誘導的巨噬細胞細胞因子分泌影響。為闡明PGD2在宿主炎癥反應中的調控作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PGD2、PGD2ELISA試劑盒、兩種前列腺品素D合成酶抑制劑HQL-79和H-PGDS抑制劑Ⅰ(H-PGDS Inhibitor Ⅰ)均購自Cayman chenical公司；總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；反轉錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；實時熒光定量PCR試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)購自Roche Applied Science公司；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自Biolegend公司；小鼠IL-10 ELISA試劑盒購自eBioscience公司；小鼠RANTES ELISA試劑盒購自PeproTech公司。兔抗COX-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗H-PGDS抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細菌野生型致病性大腸桿菌(WTE.coli，鑒定證書號：SYS110017)由本課題組分離鑒定保存[12]。

1.3 實驗動物C57BL/6J野生型小鼠購自內蒙古大學實驗動物中心，TLR2(TLR2-/-)和TLR4(TLR4-/-)基因敲除小鼠購自南京大學模型動物研究所，NLRP3基因敲除小鼠購自美國杰克遜實驗室。本試驗使用8～10周齡、體質量20 g左右的健康成年小鼠。

1.4 小鼠腹腔巨噬細胞培養和試驗處理參照文獻[10]方法進行小鼠腹腔巨噬細胞的提取，通過細胞計數將細胞密度調整至5×106個/孔，于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞完全貼壁后用于后續試驗。本研究大腸桿菌對巨噬細胞的感染量為1×106CFU/孔。在使用大腸桿菌感染野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細胞后，分別通過實時熒光定量PCR(2，4，6 h)、Western blot(0，6，12 h)和ELISA(6 h)方法分析巨噬細胞中COX-2和H-PGDS的表達水平，以及PGD2的分泌情況。在使用H-PGDS抑制劑(以抑制內源性PGD2的合成分泌)和外源性PGD2預處理巨噬細胞的試驗中，細胞培養液中HQL-79、H-PGDS抑制劑和PGD2的終濃度均為1×10-6mol/L。在預處理24 h后，使用大腸桿菌感染野生型小鼠腹腔巨噬細胞，6 h后收集細胞培養上清，并通過ELISA方法檢測分析巨噬細胞細胞因子分泌情況。

1.5 實時熒光定量PCR反應總mRNA的提取、反轉錄和實時定量RT-PCR反應按照說明書進行操作。從小鼠巨噬細胞提取的總RNA反轉錄為cDNA并進行擴增，步驟如下：使用ABI ViiA 7實時熒光定量PCR系統(Applied Biosystems)，50℃ 2 min，1個循環；95℃ 10 min，1個循環；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環。引物見表1。參照文獻[13]的方法，以持家基因GAPDH作為內參照，使用2-ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)的計算方法進行目的基因表達的統計與分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 Western blot檢測使用Western blot方法對樣本中蛋白表達的水平進行分析[10]。其中，COX-2一抗稀釋比例為1∶1 000；H-PGDS一抗稀釋比例為1∶500；GAPDH一抗稀釋比例為1∶10 000；二抗稀釋比例為1∶8 000。

1.7 ELISA檢測經H-PGDS抑制劑和PGD2預處理或未經預處理的小鼠巨噬細胞在大腸桿菌感染6 h后收集細胞培養上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養上清中PGD2、TNF-α、IL-1β、RANTES和IL-10的水平。

2 結果

2.1 TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染誘導的小鼠腹腔巨噬細胞COX-2和H-PGDS表達中的作用由圖1可見，在大腸桿菌感染后，相比于野生型小鼠來源的巨噬細胞，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細胞中COX-2 mRNA(感染4，6 h后)和蛋白的表達(感染12 h后)處于較低水平(P<0.05)。此外，在未感染狀態下，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細胞H-PGDS蛋白表達水平低于野生型巨噬細胞(P<0.001)。在大腸桿菌感染2 h后，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細胞H-PGDS mRNA表達水平與野生型巨噬細胞相比處于較低水平(P<0.001)；感染4 h后NLRP3-/-巨噬細胞H-PGDS mRNA表達水平與野生型巨噬細胞相比處于較低水平(P<0.001)；感染4，6 h后，TLR4-/-巨噬細胞H-PGDS mRNA表達水平與野生型巨噬細胞相比處于較低水平(P<0.001)，該結果與感染12 h后H-PGDS蛋白表達的結果是一致的。因此，上述結果表明TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導的巨噬細胞COX-2和H-PGDS表達。

A.COX-2 mRNA表達水平；B.COX-2蛋白表達水平；C.H-PGDS mRNA 表達水平；D.H-PGDS 蛋白表達水平圖1 大腸桿菌感染C57BL/6J野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細胞后COX-2和H-PGDS mRNA和蛋白的表達情況

2.2 TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染誘導的小鼠腹腔巨噬細胞PGD2分泌中的作用結果顯示，與野生型巨噬細胞相比，大腸桿菌誘導的TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細胞PGD2分泌顯著處于較低水平(P<0.001)，表明TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導的巨噬細胞PGD2分泌(圖2)。

圖2 大腸桿菌感染C57BL/6J野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細胞后PGD2的分泌情況

2.3 內源性PGD2對大腸桿菌誘導的小鼠巨噬細胞細胞因子分泌的影響結果顯示，與未使用前列腺素D合成酶抑制劑處理感染試驗組相比，內源性PGD2合成分泌被抑制后，大腸桿菌誘導的巨噬細胞促炎性細胞因子(TNF-α和IL-1β)、抗炎因子(IL-10)和趨化因子(RANTES)分泌出現顯著性下調(P<0.05)。上述結果表明大腸桿菌誘導的巨噬細胞細胞因子分泌在一定程度上依賴于內源性PGD2的合成分泌(圖3)。

A.TNF-α；B.IL-1β；C.IL-10；D.RANTES圖3 內源性PGD2對大腸桿菌感染誘導的巨噬細胞細胞因子分泌的影響

2.4 外源性PGD2對大腸桿菌誘導的小鼠巨噬細胞細胞因子分泌的影響結果顯示，外源性PGD2對大腸桿菌誘導的巨噬細胞促炎性細胞因子(TNF-α和IL-1β)具有上調作用(P<0.01)，同時對抗炎因子(IL-10)和趨化因子(RANTES)的分泌具有抑制作用(P<0.001)。上述結果表明外源性PGD2對大腸桿菌誘導的巨噬細胞細胞因子分泌具有調控作用(圖4)。

A.TNF-α；B.IL-1β；C.IL-10；D.RANTES圖4 外源性PGD2對大腸桿菌感染誘導的巨噬細胞細胞因子分泌的影響

3 討論

宿主天然免疫系統中模式識別受體的激活在細胞因子的分泌過程中發揮了關鍵性的作用[14]。此外，PGs的合成分泌與模式識別受體介導的天然免疫應答間具有緊密的聯系[10,15-17]。本研究結果表明，TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導的巨噬細胞PGD2合成分泌過程，并且內外源性PGD2均對大腸桿菌感染巨噬細胞后細胞因子的分泌產生影響。

WU等[10]在前期研究中發現，模式識別受體TLR2、TLR4和NLRP3的激活均參與金黃色葡萄球菌感染巨噬細胞后COX-2的表達過程，進而對PGE2的合成分泌產生影響。由于PGE2和PGD2在炎癥反應發生后的合成過程中，均需COX-2的參與，因此，猜測TLR2、TLR4和NLRP3亦可能對PGD2的合成過程產生影響。本研究結果顯示，大腸桿菌感染巨噬細胞后COX-2的正常表達依賴于上述模式識別受體的存在，而H-PGDS的表達在巨噬細胞TLR2、TLR4和NLRP3缺失后，并未出現一致性的變化規律。與COX-2表達趨勢相一致的是，大腸桿菌誘導的TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細胞PGD2分泌水平顯著低于野生型巨噬細胞。上述結果表明，雖然H-PGDS的表達可能是決定PGD2是否能夠正常分泌的重要因素，但TLR2、TLR4和NLRP3的激活更可能直接通過對COX-2表達的調控，進而影響下游PGD2的合成分泌過程。

一般認為PGD2對炎癥反應具有調控能力，但其具體作用目前尚不清楚[18]。本研究結果顯示，在大腸桿菌感染過程中，巨噬細胞促炎性細胞因子、抗炎因子和趨化因子的表達分泌一定程度上依賴于內源性PGD2的合成分泌；外源性PGD2對大腸桿菌感染巨噬細胞后促炎性細胞因子的釋放具有上調作用，對抗炎因子和趨化因子的表達具有抑制作用。上述結果表明，雖然PGD2對大腸桿菌誘導的巨噬細胞細胞因子分泌具有影響，但內源性和外源性PGD2對此過程的調控作用有所區別。

綜上所述，本研究探討了模式識別受體TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染巨噬細胞后PGD2合成分泌中的作用；此外，分析了內源性和外源性PGD2在此過程中對細胞因子分泌的影響。然而，PGD2通過何種途徑對細胞因子的分泌產生調控作用尚未明確，尚待進一步研究。