牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒GPCR基因熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

原耀賢，孫銘澮，黃偉楠，李康健，何 威，付 強(qiáng)，馬春全，劉 全，馬 駿* (.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.廣東省揭陽(yáng)市惠來(lái)縣溪西畜牧獸醫(yī)站，廣東 揭陽(yáng) 5525；.廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州 50700)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)脊髓動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的雙鏈DNA病毒——牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的牛病毒性疾病[1]。患病動(dòng)物的皮膚表面會(huì)形成堅(jiān)硬的結(jié)節(jié)或潰瘍；發(fā)病過(guò)程中體溫上升、精神萎靡、體質(zhì)量減輕、伴有流淚、流涕和流涎。患病奶牛產(chǎn)奶量減少，母牛可能會(huì)流產(chǎn)并伴有幾個(gè)月的不發(fā)情期，公牛會(huì)暫時(shí)不育或永久不育[2]，該病嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡。因此，LSD被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的疫病[3]，被我國(guó)進(jìn)境疫病名錄列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。

LSD于1929年在非洲贊比亞首次被發(fā)現(xiàn)。2013—2017年LSD由非洲傳入中東，逐漸形成了全球蔓延的趨勢(shì)[4]。2019年8月，該病傳入我國(guó)，在我國(guó)新疆伊犁地區(qū)首次暴發(fā)[5]。目前，LSD已在我國(guó)幾個(gè)省份有報(bào)道發(fā)病并執(zhí)行撲殺政策[6]。因此，鑒于LSD的流行趨勢(shì)，建立一種準(zhǔn)確、快速的LSDV檢測(cè)方法具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR，qPCR)具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原微生物的臨床檢測(cè)中。目前，我國(guó)針對(duì)LSDV的qPCR檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究基于LSDV的G-protein-coupled chemokine receptor(GPCR)基因，設(shè)計(jì)了針對(duì)LSDV的qPCR檢測(cè)方法，為早期感染動(dòng)物的發(fā)現(xiàn)和疑似病例的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和疫苗山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)疫苗株(CVCC AV41)購(gòu)自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司。小反芻獸疫(peste des petits ruminants virus，PPRV)活疫苗(Clone 9株)購(gòu)自天康生物股份有限公司。

1.2 主要試劑TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix DimerEraser均購(gòu)自TaKaRa公司；TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇等試劑均為分析純，購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中公布的LSDV-GPCR基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，合成LSDV-GPCR基因，長(zhǎng)度為1 149 bp。以此為模板，用Beacon Designer 8.1軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物qGPCR-F：5′-AGTCGAATATAAAGTAATCAGTC-3′，下游引物qGPCR-R：5′-CCGCATA-TAATACAACTTATTATAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為125 bp。基因和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建以合成的LSDV-GPCR基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，模板1.0 μL，ddH2O 7.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，回收純化PCR產(chǎn)物，將其克隆于pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV。重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。利用分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的D260 nm/D280 nm比值和濃度，根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)(拷貝/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023)/(660 Da/堿基×堿基數(shù))，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度換算為拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，得到7.11×102～7.11×109拷貝/μL等8個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，將其作為反應(yīng)模板。每個(gè)稀釋梯度設(shè)3個(gè)樣品重復(fù)并建立陰性對(duì)照。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：TB Green(2×)10 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s；60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為X軸，Cq值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)采用試劑盒提取GTPV疫苗株的基因組DNA，采用TRIzol法提取PPRV疫苗株的基因組RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取其cDNA。利用建立的qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，以pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)將pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，獲得7.11×102～7.11×109拷貝/μL等8個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，將其作為模板，進(jìn)行qPCR的敏感性檢測(cè)。同時(shí)對(duì)相同模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，比較2種檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)選取7.11×103～7.11×109拷貝/μL共7個(gè)濃度進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；在3個(gè)不同時(shí)間，對(duì)上述7個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)模板Cq值計(jì)算批內(nèi)、批間的變異系數(shù)(CV)，驗(yàn)證qPCR方法的可靠性和重復(fù)性。

1.9 模擬臨床樣品的檢測(cè)臨床采集牛的皮膚結(jié)節(jié)，淚拭子和鼻拭子各10份，分別添加不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻。采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取基因組DNA，利用本試驗(yàn)建立的qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)該組模擬臨床樣品，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，并進(jìn)行測(cè)序以及BLAST比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 LSDV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以合成的GPCR基因作為模板，用普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 149 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)。將目的基因克隆至pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19T-LSDV，對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序及BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)其為含有目的基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為91.35 mg/L，經(jīng)過(guò)公式計(jì)算得到拷貝數(shù)為7.11×1010拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以不同濃度的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。通過(guò)分析溶解曲線可得，各模板的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解峰整齊單一(圖2)，溶解溫度為(77.50±0.50)℃；以Cq值為縱坐標(biāo)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的CV大于0.999(R2>0.999)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.185 2x+37.764，R2=0.999 3，擴(kuò)增效率為106.04%，梯度稀釋的模板與Cq值呈良好的線性關(guān)系(圖3)。

圖2 qPCR的溶解曲線

圖3 LSDV qPCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 熒光定量PCR的特異性分析利用建立的qPCR方法對(duì)LSDV和GTPV的基因組DNA，PPRV的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該方法僅對(duì)LSDV有特異性擴(kuò)增，對(duì)GTPV和PPRV均無(wú)熒光信號(hào)(圖4)，表明該方法具有良好的特異性。

1.LSDV；2.GTPV；3.PPRV；4.陰性對(duì)照?qǐng)D4 qPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn)以梯度稀釋的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒(7.11×102～7.11×109拷貝/μL)為模板，進(jìn)行普通PCR檢測(cè)和qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，普通PCR可擴(kuò)增該質(zhì)粒的最低拷貝濃度為7.11×104拷貝/μL(圖5)，建立的qPCR方法對(duì)7.11×102～7.11×109拷貝/μL的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒均存在有效擴(kuò)增曲線(圖6)。2種方法相比，相差100倍。表明建立的qPCR方法較普通PCR更為敏感。

1～8.分別為7.11×109 ～7.11×102拷貝/μL；9.陰性對(duì)照?qǐng)D6 qPCR檢測(cè)pMD19T-LSDV的敏感性結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～9.重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV(7.11×109 ～7.11×102 拷貝/μL)圖5 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)選取拷貝數(shù)為7.11×103～7.11×109拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，批內(nèi)、批間的CV均小于1.5%(表1)，表明建立的qPCR檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。

表1 LSDV qPCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)(n=3)

2.6 模擬臨床樣品檢測(cè)用本研究建立的qPCR檢測(cè)方法對(duì)30份模擬臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。結(jié)果顯示，模擬臨床樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線整齊、單一(圖7)，后經(jīng)克隆測(cè)序確認(rèn)，產(chǎn)物均為L(zhǎng)SDV目標(biāo)序列。試驗(yàn)表明，建立的qPCR方法能有效地從不同臨床樣品中檢測(cè)出LSDV序列，且該方法在臨床診斷上有良好的特異性。

圖7 模擬臨床樣品的溶解曲線

3 討論

LSD的傳播對(duì)全世界多個(gè)國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量和肉牛的料肉比等價(jià)值指標(biāo)，破壞牛皮等產(chǎn)品質(zhì)量，對(duì)養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益構(gòu)成了巨大威脅。在暴發(fā)該病的初期及時(shí)進(jìn)行免疫及控制措施，能有效地減緩LSD的蔓延。而LSD的防控和診斷，是減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵，這依賴于對(duì)早期疑似病例的有效診斷。

針對(duì)LSD的鑒別方法主要依賴分子生物學(xué)檢測(cè)方法。目前， LSDV的檢測(cè)方法主要有抗原抗體ELISA檢測(cè)、Western blot、普通PCR、實(shí)時(shí)qPCR方法等[7]。ELISA和Western blot具有敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但山羊痘病毒屬各成員之間關(guān)系密切，同源性高，且能產(chǎn)生共同的中和抗體，因此，這2種方法難以應(yīng)用于LSDV的早期鑒別診斷[8]。普通PCR方法應(yīng)用廣泛，但有速度慢、敏感性低的缺點(diǎn)；而qPCR技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏、可定量等優(yōu)點(diǎn)，能為臨床的病原檢測(cè)提供更多幫助。

qPCR方法分為染料法和探針?lè)▋煞N[9]。探針?lè)ㄍㄟ^(guò)探針可以增加反應(yīng)收集信號(hào)的特異性，缺點(diǎn)是要合成探針，提高了檢測(cè)單位的門(mén)檻，也使檢測(cè)成本相對(duì)提高。染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但其特異性劣于探針?lè)āＢ櫢Ｆ降萚10]已經(jīng)基于探針?lè)ń⒘髓b別檢測(cè)LSDV野生毒株的qPCR方法，能有效區(qū)分野毒株與疫苗株。而本研究基于染料法建立的qPCR檢測(cè)方法成本低，操作簡(jiǎn)便，能特異地檢出LSDV，并且能有效的檢測(cè)臨床樣品，對(duì)疫病的快速臨床診斷具有重要意義。

本研究建立的qPCR方法能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出LSDV，是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，可以應(yīng)用于LSD的監(jiān)測(cè)與防控。