廣西豬A群輪狀病毒G9 P[7]型的分離與初步鑒定

米 雪，陳榮琳，張勝斌，劉雪婷，秦秋英，王奕斐，邊金妮，程振孔，羅允燕，羅期方，張 寧，陳 櫻，韋祖樟，黃偉堅，歐陽康* (.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；.廣西農墾永新畜牧集團西江有限公司，廣西 貴港 53704)

輪狀病毒(rotavirus)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員，其可感染多種新生動物和幼齡動物，也是引起哺乳和斷奶仔豬腹瀉的常見病因[1]。豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)可分為A、B、C、E 4個血清群,其中以A群最常見，占所有輪狀病毒腹瀉病例的90%[2]。輪狀病毒基因組由11股雙鏈RNA片段組成，大小為0.6 ～3.3 kb，編碼12種蛋白質[3]。VP4、VP6和VP7由于其獨特的生物學功能而成為最近研究的焦點。VP4是一種具有受體結合活性的非糖基化胰蛋白酶敏感蛋白，胰蛋白酶可以使VP4蛋白暴露出了具有感染性的VP5(60 kDa)和VP8(28 kDa)兩個位點，從而使病毒具有感染性[4]。

輪狀病毒的顯著特征是其基因片段在自然界或試驗條件下容易發生基因重組。有研究表明PoRV和人輪狀病毒毒株之間可發生基因重排，可引起人的腹瀉[5]。

為確定廣西貴港某豬場導致仔豬腹瀉的病原，本研究采用PCR方法檢測了引起仔豬腹瀉的3種常見病原，即豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和PoRV。檢測結果為僅PoRV陽性后，進行病毒的分離，獲得了1株能產生穩定病變的廣西地區PoRV。通過PCR鑒定、病毒分離以及電鏡觀察等生物信息學分析，確定該毒株為廣西新發的G9 P[7]型PoRV，是廣西地區首次分離到G9 P[7]型PoRV。G9型PoRV被認為是一個新興的基因型在世界各地傳播[6]，本試驗為后續G9 P[7]型PoRV的相關研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集廣西貴港某豬場出現腹瀉癥狀仔豬的腸內容物10份，用含有20%甘油和1 000 U/mL青鏈霉素的已滅菌PBS對腸內容物進行5倍稀釋，振蕩混勻后，4℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm濾器過濾用于病毒分毒。

1.2 主要材料Marc-145細胞(非洲綠猴胚胎腎細胞)由廣西大學動物科學技術學院動物傳染病與分子免疫學實驗室保存。MEM培養基和0.25% 胰酶均購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；pMD18-T購自TaKaRa公司；AxyPrep體液病毒核酸提取試劑盒購自Axygen公司；膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒均購自OMEGA公司；DH5α感受態細胞購自廣西南寧康維生物科技有限公司；PEG-8000購自Solarbio公司。

1.3 病毒接種將處理過的小腸內容物經0.22 μm濾器過濾后與質量濃度為20 mg/L的胰酶1∶1混勻，在37℃條件下作用1 h。將其按培養液的10%接種，37℃、5% CO2培養箱孵育1 h后，加入無血清的MEM培養基(含0.5 mg/L胰酶)于37℃、5% CO2培養箱靜止培養。每天觀察病變(CPE)，在細胞產生80%以上的病變時，收取病毒液。按照上述方法將病毒連續盲傳20代。

1.4 基因的擴增與序列的測定根據GenBank登錄的豬A群輪狀病毒VP4、VP6、VP7的基因序列及已發表的相關報道[7]，以及參照LARRALDE等[8]報道的VP4基因編碼氨基酸84～180區域用于VP4血清分型和亞型分型，設計3對引物，分別用于病毒的VP4部分片段以及VP6和VP7基因全長的擴增，引物均由上海杰李生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物信息

采用RNA提取試劑盒提取1.3中分離病毒的核酸，反轉錄為cDNA，再將cDNA為模板利用上述引物進行VP4、VP6、VP7基因擴增，反應程序：95℃ 3 min，94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1.5 min，35個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。將VP4、VP6、VP7基因連接pMD18-T載體進行基因克隆，構建pMD18-T-VP4、pMD18-T-VP6、pMD18-T-VP7重組質粒，由上海杰李生物技術有限公司對陽性質粒進行序列的測定。將分離株VP4、VP6和VP7基因的測序結果在NCBI上進行BLAST比對。使用MEGA 5.02軟件制作VP4和VP7基因遺傳進化樹，分析毒株遺傳進化關系。

1.5 病毒濃縮與透射電鏡觀察收集30 mL病毒液，反復凍融3次后，4℃、10 000 r/min 離心1 h，收集上清用0.22 μm濾器過濾。取7.5 mL 50% PEG-8000加入濾過后的上清，4℃溫和攪拌過夜沉淀病毒；將上述病毒上清-PEG 8000混合液于4℃、12 000 r/min 離心2 h沉淀病毒。用1 mL PBS重懸病毒沉淀，4℃攪拌混勻30 min，取100 μL病毒重懸液用于透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 病毒的分離鑒定結果提取采集的10份臨床樣品的RNA，采用PCR檢測PEDV、TGEV、PoRV病原，結果顯示，PEDV和TGEV陰性，PoRV陽性，將處理后濾過的樣品上清液接種Marc-145細胞，在盲傳至第4代時，接毒24 h后細胞出現明顯病變。正常Marc-145細胞輪廓清晰，狀態良好(圖1A)，發生病變的Marc-145細胞，細胞皺縮，顆粒增多，最后脫落(圖1B)，結果表明初步分離到1株病毒，將其命名為18GXGG毒株。

A.正常Marc-145細胞；B.分離毒株感染Marc-145細胞24 h后細胞病變圖1 細胞病變結果(200×)

將能產生穩定病變的18GXGG株盲傳20代。將收取的第5，10，15代的病毒上清進行RNA提取，PCR鑒定為PoRV陽性。取第10代的病毒RNA反轉錄后進行VP4(802 bp)、VP7(1 062 bp)和VP6(1 356 bp)基因的擴增(圖2)，連接至pMD18-T載體上由上海杰李生物技術有限公司進行測序，進一步鑒定本研究分離到1株PoRV。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.分別為VP4、VP7、VP6基因擴增產物圖2 PCR擴增結果

2.2 基因型鑒定和遺傳進化分析將18GXGG株的VP6基因序列與GenBank登錄的PoRV VP6基因進行核苷酸序列分析。結果顯示，18GXGG株VP6基因序列與國內2株PoRV的VP6基因(FJ617209.1、MT874988.1)的同源性分別為99.85%，99.78%，確定分離毒株為豬A群輪狀病毒(porcine group A rotavirus,PoRVA)。

將18GXGG株的VP4基因序列與GenBank登錄的輪狀病毒VP4基因進行核苷酸序列分析。結果顯示，18GXGG株的VP4基因序列和P[7]型韓國株(MF940546.1)的VP4基因序列同源性達到99.88%，和P[7]型中國株(AY523636.1)的VP4基因序列同源性達到99.63%。將分離病毒18GXGG株與GenBank登錄的42株不同基因型的輪狀病毒VP4基因參考序列采用MEGA5.02軟件繪制VP4基因的遺傳進化樹(圖3)，結果顯示，18GXGG株與P[7]型的韓國株(MF940546.1)和中國株(AY523636.1)親緣關系較近，且與P[7]型的輪狀病毒參考毒株形成一個分支。

·本研究分離毒株圖3 18GXGG分離株VP4基因進化樹

將18GXGG株的VP7基因序列與GenBank登錄的輪狀病毒VP7基因進行核苷酸序列分析。結果顯示，18GXGG株的VP7基因序列和屬于G9型的美國株(MN862194.1)VP7基因序列同源性高達99.80%，和G9型中國株(JF781163.1)的VP7基因序列同源性達到95.57%。將分離病毒18GXGG株與GenBank登錄的42株不同基因型的輪狀病毒VP7基因參考序列采用MEGA5.02軟件繪制VP7基因的遺傳進化樹(圖4)，結果顯示，18GXGG株與G9型的參考毒株在同一分支，并且和日本株(AB091753)親緣關系最近。

·本研究分離毒株圖4 18GXGG分離株VP7基因進化樹

通過基因型鑒定結果以及遺傳進化分析，結果表明，本研究首次分離到廣西地區PoRVA G9 P[7]型毒株。

2.3 VP4、VP7基因的變異分析應用MegAlign軟件對本研究18GXGG分離毒株與P[7]型的PoRV參考株的VP4基因氨基酸序列進行比對分析，結果顯示，廣西地區18GXGG株的VP4基因存在氨基酸的變異，第11位氨基酸(N→S)出現了變異(圖5)；將18GXGG分離毒株與G9型PoRV參考株的VP7基因氨基酸序列進行比對分析，發現廣西地區18GXGG株VP7基因氨基酸序列在208～225出現了較為集中的突變，其主要變異位置為：208位(T→I)；212位(A/T→K)；225位(V→A)；271位(I→V)(圖6)。

圖5 VP4氨基酸變異位點分析

圖6 VP7氨基酸變異位點分析

2.4 病毒粒子形態觀察PoRV粒子略呈圓形、具有雙層衣殼，形似車輪狀，病毒粒子大小約為70 nm[9]。將盲傳至第10代的18GXGG分離毒株的病毒上清液超速離心處理后，在透射電鏡下能夠觀察到略呈圓形、大小為70～75 nm呈車輪狀的單個病毒粒子，具有PoRV的形態特征(圖7，黑色箭頭處)。結果表明，本研究分離到1株PoRV。

3 討論

輪狀病毒為人畜共患病，常引起幼齡兒童和幼畜發生嚴重腹瀉，使其免疫力下降，進而感染其他病原[10]。PoRV感染在豬群中非常常見。其通常與其他腹瀉病毒呈混合感染，如PEDV，TGEV等，在養豬業中造成重大損失。目前沒有較好的治療方法，臨床上主要用接種疫苗的方法進行疾病的預防。

BISHOP等[11]首次在腹瀉的嬰幼兒糞便中發現了輪狀病毒，但在接下來的研究中發現用細胞培養分離輪狀病毒比較困難。有報道在接種病毒前使用胰蛋白酶處理病毒，然后再接種于恒河猴胎腎細胞(MA-104)，成功分離了輪狀病毒，之后發現經過胰酶處理后的輪狀病毒在ST、Marc-145和Vero等細胞上也能生長繁殖[12-13]。

事實證明，輪狀病毒的分離由于臨床樣品的復雜性而具有一定難度，本研究將樣品與質量濃度為20 mg/L的胰酶混合處理，再將病毒液接種至Marc-145細胞上，在盲傳至第4代時出現典型CPE，毒株能穩定的在細胞上生長繁殖。通過PCR初步鑒定出分離株為PoRVA G9 P[7]型，并將其命名為18GXGG，而后通過透射電鏡觀察到形似車輪狀的病毒粒子。分析18GXGG株的VP4、VP7基因氨基酸序列，發現其發生了某些氨基酸位點的變異。PoRV 18GXGG株的后續研究還需進一步探索。

輪狀病毒呈現多樣化流行趨勢，動物輪狀病毒基因重組可能導致人輪狀病毒出現動物才有的血清型，原霖[14]研究表明，人類新發的輪狀病毒如G9和G12型可能來自豬源病毒基因重組，因為輪狀病毒的G9型和G12型在豬群中檢出率較高。由于輪狀病毒不同基因型全球流行的趨勢分化以及PoRV和人輪狀病毒基因重排發生率增加，加強對PoRV的預防及檢測對公共衛生的影響顯得尤為重要。

G9型輪狀病毒被認為是全球范圍內豬和人類的新興基因型，并且G9型毒株通常與P[7]、P[13]、P[19]和P[23] 組合[15]。本研究采用Marc-145細胞，分離出新型基因型G9型，并且與P[7]型組合形成G9 P[7]型毒株。但近年來，在世界不同范圍檢測到了不常見的A群輪狀病毒G和P基因型，并且有新的輪狀病毒基因群在不同地區檢測到[16-17]。PoRV的流行性和遺傳多樣性不斷增加，豬場接種疫苗的效果也不盡人意，因此新型輪狀病毒的分離為今后疫苗的研發具有重要意義，以增強我國PoRV的有效預防。