利用Red/ET重組技術構建表達非洲豬瘟病毒CP530R和F317L基因的重組偽狂犬病毒

孔 潔,邵洋洋,喬延召,趙琪琪,李鴻鑫,張新珩,藺文成,陳偉國,謝青梅 (華南農業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

自2018年8月以來，我國已有多個省份發(fā)生非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情，ASF給我國養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。ASF是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的豬的一種急性、烈性傳染性疾病[1]，鑒于目前該疫病在全球多個國家蔓延，開展疫情防控工作、研發(fā)新型ASF疫苗已迫在眉睫。ASFV屬于雙股線型DNA病毒，具有多層結構和二十面體形態(tài)，其基因組編碼超過150多種病毒蛋白[2-3]。pp62多聚蛋白是ASFV非常重要的一類結構蛋白，該蛋白可以加工合成兩個核心蛋白——p35和p15，存在于病毒顆粒的核殼，由CP530R基因編碼合成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，pp220是病毒內部核心殼的主要成分之一，兩種多聚蛋白前期的加工都伴隨著病毒的組裝，當pp62多聚蛋白的表達受到阻遏，間接影響pp220多聚蛋白的離域化[5]，引起病毒工廠中具有不同核心發(fā)育水平的異常病毒顆粒積聚。未知蛋白(hypothetical proteins)是指缺少功能注釋信息的蛋白[6]。在成熟的ASFV粒子中，目前已檢測到68種蛋白質，結構蛋白主要參與病毒的復制和病毒粒子的形成，至今仍未知其功能的蛋白質占30%左右，其中包括F317 L[7]。

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，臨床上能夠引起豬的繁殖障礙。該病毒基因組龐大，全長約145 kb，由于病毒感染宿主范圍廣，且含有多個非必需基因，可供多種外源基因插入并穩(wěn)定表達[8]。已有研究表明，復制非必需區(qū)基因(TK、PK、gE、gI和gG等)能夠作為外源基因的插入位點，缺失突變后可使野生株PRV侵入中樞神經系統(tǒng)[9]，顯著降低病毒毒力。迄今為止,已有多種標記基因和致病微生物的中和抗原基因在該病毒中獲得穩(wěn)定表達[10]，目前該病毒已成為多種新型活載體疫苗的理想載體。

重組病毒活載體疫苗是利用DNA重組等一系列基因工程技術，通過對特定病毒的基因組進行改造，將外源性抗原基因插入到載體病毒中進行表達的一類新型疫苗[11]。“Red/ET重組”是近年發(fā)展起來的一種基于同源重組原理在大腸桿菌中直接修飾各類DNA分子的新技術[12]。Red/ET重組技術是利用重組酶Redα/β或RecE/T介導的同源重組對DNA精確修飾的技術[13]。與傳統(tǒng)的方法比較，該技術具有不受酶切位點限制，不受基因大小限制、無痕修飾、快速操作等優(yōu)點。利用該技術可以對多株重組病毒目的基因進行修飾[14-15]。為了減少背景菌落影響，提高篩選效率，利用反向篩選標記ccdB以獲得修飾的目的DNA，充分展示了該技術結合反向篩選標記ccdB的可操作性和實行性。本研究利用Red/ET重組工程技術和ccdB反向篩選標記，將ASFV CP530R和F317L同時插入到PRV TK位點，構建表達ASFV CP530R和F317L基因的重組PRV，為ASFV新型活載體疫苗的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料真核表達載體pVAX1購自Invitrogen公司；E.coliDH5α 感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司；Gel Extractin Kit、Plasmid Kit、Cycle Pure Kit均購自OMEGA；限制性內切酶購自Biolabs公司；克隆載體pMD-19T Vector、DNA 聚合酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司；PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH質粒由上海生工生物公司合成；質粒pBeloBAC11-cm和表達重組蛋白RecE/RecT的E.coliGBred/GBredA462感受態(tài)由山東大學張友明教授惠贈；PRV(Bartha-K61)毒株、rBartha-K61-EGFP(TK)重組毒株、pBeloBAC11-cm-Bartha-K61質粒、Vero細胞、PK-15細胞均由華南農業(yè)大學家禽研究室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR引物設計及合成以PBR322-Amp-ccdB質粒為模板，擴增含HA同源臂的(TK)-Amp-ccdB-(TK)載體(篩選標記基因片段)。F1：5′-CTCGGCGGGGCGCTGTACGTGCCCGAGCCG-ATGGCGTACTTTAATTAATTTGTTTATTT-TTCTAAATA-3′；R1：5′-GGAAGCACACCGTC-GCGGCCACCGGGTGGCGGTCAAAGACTTAA-TTAATTATATTCCCCAGAACATCAG-3′(限制性內切酶PacⅠ酶切位點)；以PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH質粒為模板，擴增含HA同源臂的基因片段((TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK))。F2：5′-CTCGGCGGGGCGCTGTACGTGCCCGAGCCGATGGCGTACTTTAATTAAGA-CATTGATTATTGACTAGT-3′；R2：5′-GGAAGCACACCGTCGCGGCCACCGGGTGGCGGTCA-AAGACTTAATTAATGTCCATAAAACCGCC-CAGT-3′(限制性內切酶Pac Ⅰ酶切位點)。

PCR反應體系：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，Template DNA 1 μL，引物(F/R)各2 μL，ddH2O補足50 μL。PCR擴增程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)；72℃ 3 min，PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并測序。

1.3 重組病毒的構建及兩步法轉化由上海生工生物合成的ASFV抗原基因來源于中國流行毒株Pig/CN/HLJ/2018(GenBank：MK333180.1)，命名為：PUC57-CMV-CP530R-F317L-BGH。以PBR-322-Amp-ccdB為模板，(TK)Amp-ccdB-F/(TK)Amp-ccdB-R為引物，PCR擴增(TK)-Amp-ccdB-(TK)篩選標記基因片段。以基因合成的質粒為模板，利用通用引物(TK)CMV-F/(TK)BGH-R，PCR方法擴增外源基因片段，命名為：(TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK)。

將制備好的基因片段(TK)-Amp-ccdB-(TK)與pBeloBAC11-cm-Bartha-k61載體進行同源重組，將RecE/RecT重組蛋白轉化至感受態(tài)GB redA462，涂布于Amp抗性的LB平板，重組質粒命名為 pBeloBAC11-cm-Bartha-k61-(TK)-Amp-ccdB-(TK)，完成與環(huán)狀載體第1步重組病毒的轉化。將制備好的基因片段(TK)-CMV-CP530R-F317L-BGH-(TK)與pBeloBAC11-cm-Barthak61-(TK)-Amp-ccdB-(TK)質粒進行同源重組，將RecE/RecT重組蛋白轉化至感受態(tài)GB red，涂布于氯霉素抗性的LB平板，進行第2步重組病毒的轉化。

1.4 感染性克隆的篩選與鑒定電轉完成后立即加入1 mL SOC培養(yǎng)基至電擊杯中，將菌體重懸并轉移至2 mL離心管中，37℃，260 r/min培養(yǎng)1 h完成重組及抗性復蘇。3 000 r/min離心1 min沉淀菌體，保留部分上清并吹打重懸，涂布含有Amp抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落，37℃，260 r/min培養(yǎng)12 h。以(TK)CMV-F/(TK)BGH引物進行菌液PCR初步鑒定，提取質粒進行Pac Ⅰ酶切鑒定，鑒定正確的質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為：pBeloBAC11-cm-Bartha-k61-(TK)- CP530R-F317L-(TK)。

1.5 病毒拯救鑒定用鑒定正確的重組質粒pBeloBAC11-Bartha-K61-(TK)CMV-CP530R-F317L-BGH按照LipoTM3000說明書轉染Vero細胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，收獲細胞及上清，接種至PK-15細胞，盲傳5代，收獲病毒液進行拯救病毒鑒定。病毒感染后出現(xiàn)空泡等典型噬斑狀態(tài)，酶切正確的克隆命名為：rBartha-K61-CP530R-F317L，抽提病毒基因組DNA，PCR擴增基因片段并進行鑒定。

取rBartha-K61-CP530R-F317L株病毒液接種至PK-15細胞(MOI=1)，收取細胞，一抗使用鼠源Flag標簽蛋白多克隆抗體(1∶750稀釋)進行孵育，二抗使用FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀釋)進行孵育，Western blot鑒定蛋白表達。

1.6 感染性克隆的穩(wěn)定性試驗將感染性克隆rBartha-K61-CP530R-F317L以MOI=1接種PK-15細胞，48 h產生明顯病變，反復凍融3次后收獲病毒，一步生長曲線測定病毒TCID50。連續(xù)傳代20次，每隔5代提取感染性克隆的基因組DNA，按照1.4方法進行PCR鑒定，第20代按照1.5方法進行Western blot鑒定。

2 結果

2.1 PCR擴增及測序含有同源臂的目的基因擴增結果顯示，目的條帶大小約為2 671 bp(圖1A)，擴增片段與預期大小一致，膠回收目的條帶并進行克隆測序；Amp-ccdB篩選標記基因擴增結果顯示，目的條帶大小約為1 307 bp(圖1B)，擴增片段與預期大小一致，膠回收目的條帶并進行克隆測序。

A.含有同源臂的目的基因；B.Amp-ccdB篩選標記基因圖1 含有同源臂的CP530R-F317L基因和Amp-ccdB片段擴增結果

2.2 真核表達重組質粒鑒定將目的基因定向克隆到真核表達載體上，使用質粒抽提試劑盒對陽性菌液進行抽提，限制性內切酶PacⅠ對抽提質粒進行酶切鑒定，結果顯示在3 646,7 516,58 803,78 782 bp處可見4條與預期大小一致的條帶(圖2)，膠回收目的條帶并進行測序驗證，測序結果顯示正確，說明重組質粒構建成功。

圖2 真核表達重組質粒的酶切鑒定

2.3 真核表達重組質粒篩選將鑒定正確的重組質粒轉染至Vero細胞后48 h收獲細胞及上清，接種PK-15細胞，盲傳至第5代時，PK-15細胞膨大變圓，隨之細胞變性圓縮，最后細胞脫落聚集，形成空斑等典型CPE現(xiàn)象(圖3)，將該拯救毒株命名為rBartha-K61-CP530R-F317L，連續(xù)傳代20代后未發(fā)現(xiàn)變異。

A.空白對照細胞；B.感染后的細胞病變圖3 重組病毒質粒感染PK-15細胞病變

2.4 感染性克隆的穩(wěn)定性試驗

2.4.1感染性克隆的蛋白鑒定 以rBartha-K61-CP530R-F317L為模板，PCR擴增含同源臂的目的基因，目的條帶與預期大小一致。為驗證感染性克隆的蛋白表達情況，將rBartha-K61-CP530R-F317L感染性克隆，以MOI=1接種至細胞培養(yǎng)6孔板單層PK-15細胞,使用帶有HA標簽多克隆抗體進行Western blot檢測，結果顯示(圖4)，rBartha-K61-CP530R-F317L感染性克隆組檢測到HA標簽蛋白，疫苗株Bartha-K61未檢測到HA標簽蛋白。

圖4 感染性克隆的蛋白鑒定

2.4.2感染性克隆的一步生長曲線 利用Reed-Muench法[16]計算Bartha-K61疫苗株、rBartha-K61-EGFP(TK)、rBartha-K61-CP530R-F317L重組病毒不同時間點的TCID50，繪制一步生長曲線(圖5)。重組病毒能在PK-15易感細胞上快速增殖，病毒滴度峰值可達105.8TCID50/mL，與原始毒株Bartha-K61存在差異，但與rBartha-K61-EGFP(TK)重組毒株無明顯差異(表1)。

圖5 感染性克隆的一步生長曲線

表1 不同時間點病毒滴度測定(lgTCID50)

3 討論

自2018年8月至今，ASF在全球范圍內的廣泛傳播造成了巨大的經濟損失，ASF疫情的流行特征及動態(tài)變化迫切要求有效的預防控制措施，開發(fā)及研制高效、安全的新型疫苗具有重要的研究意義。在宿主和病毒長期共存的漫長過程中，病毒進化了各種免疫逃逸機制以逃避宿主的免疫應答[17-19]，ASFV擁有復雜且龐大的基因組，編碼多種免疫逃逸蛋白抑制宿主免疫應答，使得該病尚未有有效疫苗問世[20-22]，現(xiàn)階段在做好ASFV防控保障工作的同時，越來越多的國家將工作重心趨向于研究新型ASF疫苗以此進行免疫評估。

目前，針對ASF預防在畜禽研究中的范圍和內容十分廣泛，尤其是在臨床病例中不同類型疫苗的開發(fā)及應用。早期ASF疫苗研制的重心主要聚焦于滅活疫苗，但前期研究表明，ASFV滅活疫苗雖可刺激機體產生不同強度的免疫應答，但仍無法誘導宿主產生中和性抗體，尚未呈現(xiàn)良好的中和作用。BLOME等[23]研究發(fā)現(xiàn)，使用新型佐劑(PolygenTM或Emulsigen?-D)與滅活的ASFV疫苗配伍，均可檢測到ASFV特異性抗體，但未觀察到免疫的保護作用。與基因缺失減毒活疫苗相比，DNA疫苗是將病毒編碼的主要蛋白基因通過克隆等一系列方式插入真核表達載體，構成重組真核表達載體刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答。ARGILAGUET等[24]將ASFV血凝素(sHA)的胞外域與兩種病毒抗原——p54和p30融合后，雖可刺激機體產生體液免疫和細胞免疫，但無法起到攻毒保護，研究者進一步將新的重組質粒pCMV-UbsHAPQ與泛素融合的病毒決定簇——sHA，p54和p30，發(fā)現(xiàn)僅能夠改善并刺激機體產生部分免疫保護。安全性是影響弱毒活疫苗臨床應用最關鍵的影響因素之一[25]，ASFV弱毒活疫苗主要分為3類——傳代致弱、重組致弱和天然致弱。KRUG等[26]將ASFV-G野毒株在Vero細胞中連續(xù)傳代110次，體外評估獲得病毒在Vero細胞和豬原代巨噬細胞中復制的能力，體內評估對豬的毒性，病毒全長序列分析顯示出病毒具有明顯的缺失。重組活載體疫苗是指將病毒的保護性抗原通過分子生物學技術插入到病毒載體上，以期獲得有效的免疫反應和免疫保護。引起體液和細胞介導免疫反應的策略是使用病毒載體。LOKHANDWALA等[27]首次采用“雞尾酒療法”，將多種抗原混合物與佐劑配伍使用，快速誘導了ASFV抗原特異性抗體及針對所有抗原的細胞免疫反應，該項研究首次證明使用Ad-ASFV多種抗原共同誘導商業(yè)豬抗原特異性CTL反應。現(xiàn)階段，仍需要進行大量的臨床試驗驗證重組活載體疫苗的安全性和必要性。

Red/ET重組技術是建立在同源重組基礎上，對大腸桿菌中DNA分子進行高效修飾的遺傳工程技術。Red/ET技術由重組酶——Redα/β或RecE/T催化DNA分子，Redα/β是由來源于λ噬菌體的pL操縱子的redα和redβ基因編碼的重組蛋白；RecE/T是分別由來源于E.coliRac前噬菌體的recE和recT基因編碼的重組蛋白[28]。研究發(fā)現(xiàn)，針對“線線”重組，重組酶RecE/T比Redα/β介導效率更高，而 Redα/β介導“線環(huán)”重組效率更高，Redα/β蛋白能夠高效介導線性DNA分子和環(huán)狀DNA分子之間發(fā)生同源重組[29-30]。利用Red/ET重組對目的基因進行修飾，為了減少背景菌落影響，提高篩選效率，科研人員提出了“兩步走”的策略[31]。常用的正篩選標記包括各種抗生素抗性基因等，負篩選標記包括sacB、rspL、galK和ccdB等[32]。ccdB會通過促進遺傳物質的廣泛損傷來快速殺滅細菌，作用于的靶標是解旋酶的GyrA亞基，阻止DNA復制和轉錄，從而導致細胞死亡。

本研究利用Red/ET重組工程技術和ccdB反向篩選技術，將ASFV特定基因——CP530R-F317L，定向插入到PRV TK位點，最終表達ASF的特定抗原基因，重組活載體疫苗具有良好的遺傳穩(wěn)定性和增殖型，為新型ASFV疫苗的開發(fā)提供了理論基礎。