PEDV-RBD基因在昆蟲桿狀病毒中的表達與鑒定

伊立超，李樂天，郝嘉翼，時小雙，張 爽，高子函，金寧一，婁安鋼*，李 昌* (.延邊大學 農學院，吉林 延吉33000；.中國農業科學院 長春獸醫研究所 中國醫學科學院 人獸共患病毒病防控關鍵技術研究創新單元，吉林 長春 30)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)的α-冠狀病毒屬成員，能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。1971年英國首次報道了PEDV，1978年該病在英國[1]和比利時[2]暴發期間進行了病原鑒定，我國于1984年確定豬群存在PEDV感染[3]，2013年美國首次從豬中分離到PEDV[4]。豬群感染PEDV后，其免疫力大幅度下降，導致繼發感染其他病原體，使得病情更加復雜[5-6]。

1.2治療方法:對照組患者給予吸氧、保持呼吸道通暢,抗感染,平喘,祛痰,適當強心,利尿,糾正水、鹽、電解質及酸堿平衡紊亂等綜合治療。觀察組在對照組基礎上,另外給予低分子肝素鈣4000U皮下注射,2次/d,再給予前列地爾10μg靜脈注射,1次/d,總療程10d。

PEDV表面具有一個18～23 nm纖突的囊膜結構，纖突呈花瓣狀，由核心向四周呈放射狀分布，纖突末端呈球狀；病毒直徑為95～190 nm，是一種單股正鏈、不分節段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，含有7個開放閱讀框，分別編碼大小為150 ～ 220 kDa的病毒纖突糖蛋白(S)、20～30 kDa的次要嵌合蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣殼蛋白(N)與其他蛋白。PEDV整個基因組的編碼順序為5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR[7-8]。病毒表面的纖突蛋白(spike，S)具有介導細胞附著和膜融合的作用[9]。某些哺乳動物冠狀病毒的S蛋白能被相關的蛋白酶切割成S1和S2；S1具有受體結合位點，S2具有融合活性。S1區內318～510氨基酸殘基可與ACE2[10-12]的肽酶域緊密結合。該片段為受體結合域(receptor-binding domain，RBD)，是決定病毒-受體相互作用的關鍵序列，也決定著病毒的宿主范圍和嗜性[13]。

目前預防PED的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗，但疫苗株與近期流行株同源性較低，能保護仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價的疫苗需求更加迫切[14]。為此，本試驗針對高發的GⅡ-a型流行株PEDV的S蛋白中的RBD，應用桿狀病毒表達系統進行PEDV受體結合區(PEDV-RBD)基因表達，為PEDV診斷和亞單位疫苗研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種及試劑T4DNA連接酶、DNA Marker、Trans1-T1感受態細胞購自TaKaRa公司；pFastBacTM雙載體、EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、DH10 Bac感受態購自Thermo Scientific公司；Anti-strep tag抗體購自Abcam；PEDV S蛋白抗體購自云之羽生物；HRP標記山羊抗鼠IgG、FITC標記山羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術公司。

1.2 目的基因設計與合成參考GenBank登錄的PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)，選取其RBD基因序列，在序列上游添加EcoR Ⅰ酶切位點，下游添加Xba Ⅰ酶切位點，設計完成后，進行桿狀病毒表達系統偏愛密碼子優化，由南京金斯瑞公司合成。

1.3 重組質粒的構建與鑒定將合成的基因PEDV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達載體的PH啟動子下游，命名為pFBD-PER，用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ進行雙酶切鑒定。

泰州大橋針對不同等級風險建立了層次分明的責任體系：重大風險需上報上級主管部門，同時風險控制措施的實施由公司安全辦公室直接負責；較大風險由公司安全部門直接負責；一般風險由基層管理單位負責人負責；可忽略風險由生產現場作業人員根據需要合理控制.

1.4 重組桿粒的制備將質粒pFBD-PER轉化到DH10BacTM感受態細胞中，制備含有10 mg/L 四環素、50 mg/L 硫酸卡鈉霉素、7 mg/L 慶大霉素、40 mg/L IPTG和100 mg/L X-Gal 藍白斑篩選平板。將熱激后的感受態細胞涂布在平板上，在37℃溫箱中倒置培養48 h。挑取較大的白色菌落到液體三抗(四環素(10 mg/L)、硫酸卡鈉霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)培養基中，在37℃、220 r/min搖床培養12 h。按照表1引物進行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的菌株提取桿粒，命名為Bacmid-PER。

表1 引物信息

1.5 重組桿狀病毒的拯救在6孔板中27℃培養Sf9細胞至80%，更換2 mL完全培養基(含1.5%胎牛血清Grace's培養基)，使用雙無Grace's培養基稀釋4 μg陽性重組桿粒Bacmid-PER與4 μL CellfectinTMⅡ Reagent混勻，靜置20 min后，緩慢均勻加入6孔板中，27℃培養6 h，換液為Sf-900 Ⅱ完全培養基，27℃培養5～7 d，每天觀察細胞狀態，待大部分細胞出現病變時，收取上清為第1代重組桿狀病毒，命名為rBV-PER，然后繼續盲傳3代。

1.6 間接免疫熒光法(IFA)鑒定PEDV-RBD蛋白的表達將Sf9細胞均勻鋪入6孔板，待細胞長至70%，接種重組桿狀病毒rBV-PER，每孔20 μL。27℃培養48 h后棄掉培養基,用4%多聚甲醛固定液固定30 min，Trion X-100透化處理10 min，PBS清洗1次。5%脫脂乳封閉1 h，1∶1 000稀釋Anti-strep tag抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，各室溫孵育2 h;PBS清洗1次,用1∶2 000稀釋FITC-標記的山羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h，PBS清洗1次后，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.7 Western blot檢測PEDV-RBD蛋白的表達收集感染rBV-PER的Sf9細胞，細胞破碎處理后，12 000 r/min離心2 min,收取上清制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE電泳，將蛋白轉印至NC膜上，以1∶1 000稀釋的Anti-strep tag為抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，1∶5 000稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗，分別進行Western blot鑒定。

楚合磊等[6]總結了國內外廢橡膠與廢塑料在制造阻尼材料方面的研究和應用的成果。分別介紹了廢橡膠作為減震降噪的阻尼材料在工程和工業中的研究應用，廢膠粉與廢塑料共混改性型阻尼材料、樹脂型廢膠粉阻尼材料的研究應用。研究表明，廢橡膠和廢塑料制造阻尼材料用于生產實踐,不僅可以起到減震降噪作用,而且能夠節約資源,具有顯著的環保效益，對于資源的可持續性發展具有重要意義。

2.8 PER蛋白表達的條件優化將30，48，72，96 h按照接毒量1，5，8，10 MOI收獲的細胞培養液3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，進行Western blot鑒定，同時使用β-actin作為內參(圖8)進行修正，選擇表達量較高的48，72 h的目的條帶和內參條帶，用Image J進行灰度分析，內參修正后，用GraphPad Prism 6.02作圖分析，t檢驗顯示每兩組均滿足P<0.001，差異極顯著，表明10 MOI、48 h的表達量為最高(圖9)。

2 結果

2.1 目的基因測序結果分析本研究所選取的目的基因序列來自于我國南方流行株(GenBank登錄號：AKN45969.1)，為GⅡ-a型流行株，將其與NCBI上已知的我國比較典型的其他毒株的PEDV-RBD序列進行基因進化分析(圖1)，同源性分析顯示，該氨基酸序列與其他分離株的同源性為93.3%～100.0%，表明RBD基因氨基酸序列具有一定的保守性。

圖1 PEDV-RBD基因分析

2.2 目的基因設計與合成以PEDV流行株(NCBI ID：AKN45969.1)S蛋白為基礎，利用信號肽預測工具，保留氨基酸殘基1～18位置作為信號肽，507～640位置為RBD(圖2A)，同時，N端添加Kozak起始序列、Twin-Strep 標簽，兩端分別添加酶切位點EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ(圖2B)。

圖2 PEDV-RBD基因結構示意圖

夕陽透過玻璃窗，使整個房子變成了暖調子，爐上飄著煙，兩老正忙著把拉長的面一片一片地揪下來，扔進飄著肉香的鍋里。才讓抽著煙，給我們講述他和張偉的故事。此時此刻我只有一個心愿，回去一定要幫他找到張偉。

Adachi等[14]指出，硅質巖的Al/(Al+Fe+Mn)比值由0.01(純熱水成因)至0.60(純生物成因)，并且其比值隨距熱水系統中心距離的增加而變大[15]。研究區硅質巖的Al/(Al+Fe+Mn)比值為0.16～0.48，平均為0.36。在Fe-Mn-Al三角判別圖解(圖2a)中，K6001G01和K9001E01落在熱水成因硅質巖區，K7001H01、K7001H02和M5001G01落入非熱水成因硅質巖區。

M.DL5000 DNA Marker；1.重組質粒；2.重組質粒雙酶切產物圖3 pFastBacTMDual-PER酶切鑒定結果

2.5 重組桿狀病毒rBV-PER的獲得重組桿粒Bacmid-PER轉染Sf9細胞7 d內產生P1代毒，轉染120 h后Sf9細胞均出現細胞變圓、體積變大、破裂，細胞數目減少，細胞核明顯增大(圖5A)。P3代重組桿狀病毒感染Sf9細胞48 h，出現典型CPE(圖5B)，而正常細胞無變化(圖5C)，表明重組桿狀病毒rBV-PER拯救成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.菌液PCR；2.空白對照圖4 Bacmid-PER菌液PCR鑒定結果

2.4 重組桿粒Bacmid-PER的鑒定利用表1引物對Bacmid-PER菌液進行PCR擴增，結果顯示，應用引物PH-F和M13-R得到約為1 000 bp的條帶，與預期結果一致(圖4)，表明重組桿粒Bacmid-PER構建成功。

A.重組桿粒Bacmid-PER轉染120 h的Sf9細胞病變；B.P3代重組桿狀病毒感染48 h的Sf9細胞病變；C.正常的Sf9細胞圖5 重組桿狀病毒的拯救(400×)

2.7 重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定收集感染rBV-PER的Sf9細胞，用IP裂解液和超聲裂解液破碎，12 000 r/min離心2 min,收取上清制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE電泳，將蛋白轉印至NC膜上，以1∶1 000稀釋Anti-strep tag抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，1∶5 000稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗，分別進行Western blot鑒定，可見25 kDa的目的蛋白條帶，與理論值相符，表明PEDV-RBD蛋白成功表達并具有反應原性(圖7)。

A.正常Sf9細胞；B.用Anti-strep tag抗體鑒定重組桿粒Bacmid-PER轉染120 h的Sf9細胞；C.用抗PEDV S蛋白抗體鑒定重組桿粒Bacmid-PER轉染120 h的Sf9細胞圖6 IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達

2.6 IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達利用Anti-strep tag抗體和抗PEDV S蛋白抗體對重組桿狀病毒進行IFA鑒定，結果顯示，正常Sf9細胞未出現特異性熒光(圖6A)，而感染重組病毒rBV-PER的Sf9細胞出現特異性熒光(圖6B)，表明外源PEDV-RBD基因在桿狀病毒中成功表達。

M.蛋白Marker；1. Anti-strep tag抗體鑒定重組蛋白pFBD-PER；2. 抗PEDV S蛋白抗體鑒定重組蛋白pFBD-PER；3. 空白對照圖7 重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定

1.8 PER蛋白表達的條件優化確定蛋白為可溶性表達后，按照不同接毒量(MOI為1，5，8,10)和不同表達時間(30，48，72，96 h)進行表達條件的優化，以期獲得PER蛋白表達的最佳條件。接毒后按照以上時間每次收集1 mL細胞培養液，然后將細胞培養液3 000 r/min離心5 min，收集上清液，與內參β-actin同時進行Western blot鑒定，對Western blot條帶進行灰度分析，相應的目的條帶數值減去內參條帶數值，重復3次，然后用GraphPad Prism 6.02作圖分析。

2.3 重組質粒鑒定質粒pFBD-PER用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ進行雙酶切鑒定，結果顯示，可得到1條約為680 bp的目的基因條帶，表明質粒構建成功(圖3)。DNA測序鑒定結果進一步表明，目的序列與原序列完全一致。

M.蛋白Marker；1～4.接毒量1，5，8，10 MOI圖8 重組蛋白pFBD-PER的表達條件優化

1～4.接毒量1，5，8，10 MOI；注：每兩組均滿足P<0.001圖9 重組蛋白pFBD-PER的表達條件優化灰度值分析

3 討論

S蛋白作為PEDV的重要抗原，攜帶主要的B淋巴細胞抗原表位。B細胞表位由抗原表面的親水性氨基酸組成，容易接近B細胞受體和抗體分子并被識別，誘導機體產生與PEDV特異性結合的中和抗體。

作為經濟社會發展處于全國較高水平、基本公共服務供給絕對量處于全國領先的長三角地區，其基本公共服務是不是也存在比較嚴重的發展不均衡問題？與全國相比情況如何？造成這種狀況的主要原因是什么？如何在全面小康目標的推進中，在區域基本公共服務的供給上不斷滿足人民群眾不斷增長的更高質量的服務需求？對于經濟社會發展的一體化水平較高、早已提出率先實現全面高水平小康社會的長三角地區來說，研究上述問題顯然可以為我們的政策實踐提供價值導向和重要依據。

研究發現，用PEDV S1蛋白免疫懷孕母豬，通過其初乳哺乳的仔豬可以獲得針對PEDV的被動體液免疫[15]。MAKADIYA等[16]成功構建PEDV S1蛋白的真核表達載體，并將其轉染人胚腎HEK-293T細胞，Western blot結果顯示該蛋白能與PEDV高免血清發生特異性反應；純化該重組蛋白后免疫懷孕母豬，在其血清中即可檢測到高滴度的PEDV中和抗體，PEDV攻毒后免疫組哺乳仔豬未表現出明顯臨床癥狀，且死亡率明顯降低。沈安寧[17]構建原核表達載體，成功表達PEDV S蛋白并成功制備出單克隆抗體。王加圓[18]構建了PEDV S1抗原位點原核表達載體和真核表達載體，均成功串聯表達S1抗原位點蛋白，用兩種系統表達的蛋白免疫小鼠后血清中均產生了不同程度的特異性抗體和中和抗體。吳松[19]利用昆蟲桿狀病毒表達系統成功表達了PEDV S1蛋白，免疫豬后均產生了特異性抗體和中和抗體。武旺盛等[20]用HEK-293T細胞成功表達了PEDV S1蛋白，用蛋白免疫巴馬小型豬后，誘導其產生黏膜免疫。

本研究針對的PEDV-RBD是重要的免疫原性區域，含有多個抗原表位[12]，其誘導產生的抗體多為中和性抗體，是阻斷病毒與細胞結合，刺激宿主免疫反應、中和抗體及保護免疫系統免受病毒感染的主要成分。RBD的受體結合基序與細胞受體相互作用，介導病毒與宿主細胞的黏附。針對S蛋白RBD的特異性中和單克隆抗體可以有效地阻斷病毒入侵，其被認為是一個關鍵的治療靶點[21]。但尚未見圍繞PEDV受體結合區開展表達或疫苗研究的相關報道。

（3）STA通過信道1（AP1使用的信道）向AP1發送802.11解除關聯信息，解除STA與AP1間的關聯。

本研究選用桿狀病毒作為表達系統，因其作為一種重要的真核表達系統，目前研究比較成熟且高效。桿狀病毒表達系統的表達產物在生物學活性、結構與功能特性、抗原性和免疫原性與天然外源基因產物非常相似。桿狀病毒有很高的種屬特異性，不感染脊椎動物，其表達產物生物安全性較高[22]。目前已有應用該系統進行BTV、HPV疫苗研究[23-25]的報道。

本研究將PEDV-RBD基因正確插入桿狀病毒表達載體，成功構建了重組質粒pFBD-PER，并獲得穿梭質粒;利用脂質體轉染方法將質粒轉染Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒，成功地利用昆蟲表達系統表達了PEDV-RBD蛋白，所表達蛋白的相對分子質量約為25 kDa；IFA和Western blot檢測結果均表明，桿狀病毒表達系統能夠正確表達PEDV-RBD蛋白，且PEDV-RBD蛋白具有良好的抗原性。本研究首次利用昆蟲桿狀病毒真核表達系統成功表達了PEDV-RBD蛋白，為進一步研究PEDV-RBD蛋白的生物學功能、研發診斷試劑、制備基因工程亞單位疫苗奠定了基礎，也為利用昆蟲桿狀病毒表達系統進行其他冠狀病毒結構蛋白的表達提供了依據。