豬流行性腹瀉病毒HB2018的分離鑒定及致病性

耿 超，陸泓宇，梁 婉，周丹娜，楊克禮，郭 銳，袁芳艷，劉 威，高 婷 ，劉澤文，趙紅梅，田永祥* (1.長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 43405；.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可引起一種以嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征的急性、高度接觸性傳染病。各年齡段豬對(duì)該病毒均易感，7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬癥狀最為嚴(yán)重，感染致死率高達(dá)90%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

2010年，世界范圍內(nèi)暴發(fā)大規(guī)模PEDV疫情，其中，PEDV的S基因變異是毒株毒力改變的主要原因[3]。病原學(xué)研究顯示，與疫苗毒株CV777相比，流行毒株發(fā)生了較大的變異，其S基因同源性為91%～94%[4]。隨著PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)二聯(lián)滅活疫苗，PEDV、TGEV和豬輪狀病毒(PoRV)(G5型)三聯(lián)活疫苗以及抗病毒制劑等防控產(chǎn)品的商品化，PEDV疫情得到了控制[5-6]，但是PEDV的變異依然十分活躍，需要密切關(guān)注其變異趨勢(shì)，為疫病的防控做好儲(chǔ)備。

本試驗(yàn)分離得到1株可以在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的PEDV變異株，并擴(kuò)增測(cè)定其S基因序列，通過(guò)遺傳進(jìn)化分析，可以得出近年來(lái)PEDV流行株的變異趨勢(shì)。測(cè)定分離株的病毒滴度以及設(shè)計(jì)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，研究目前流行的PEDV變異株的特性，將為PEDV疫情的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17份病死仔豬的小腸病料采自湖北省發(fā)生腹瀉的豬場(chǎng)，PEDV檢測(cè)有7份為陽(yáng)性，TGEV和偽狂犬病病毒(PRV)檢測(cè)均為陰性；Vero細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。10只26日齡健康仔豬購(gòu)自湖北省某豬場(chǎng)，RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)豬的PEDV、TGEV和PRV為陰性，PEDV-IgG酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián))檢測(cè)仔豬的血清抗體為陰性。

1.2 主要試劑DL2000 DNA Marker、2×Phanta Max Master Mix購(gòu)自Vazyme公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)自Gbico公司；中性紅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；pMD18-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PEDV抗體IgG(PEDV-IgG)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)科技生物科技有限公司。

1.3 樣品的處理和檢測(cè)將采集的病料剪取合適大小置于2 mL離心管底部，加入1 mL pH 7.4的PBS緩沖液。用組織破碎儀27次/s破碎10 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清，根據(jù)AXYGEN公司的DNA/RNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組，運(yùn)用多重RT-PCR的方法進(jìn)行鑒定[7]。將PEDV為陽(yáng)性的上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后，加入1%雙抗，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒的分離與純化將1 mL處理好的病毒液接種單層Vero細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱37℃孵育2 h，棄上清，加入含7.5 mg /L的胰酶DMEM培養(yǎng)基6 mL，待細(xì)胞出現(xiàn)70%～80%病變，收取病毒液，反復(fù)凍融3次分裝備用。參照文獻(xiàn)[8]的噬斑試驗(yàn)和病毒滴度的測(cè)定方法，利用Vero細(xì)胞純化F20代的病毒液，運(yùn)用Reed-Muench法計(jì)算病毒液的TCID50。

1.5 S基因的克隆參考NCBI公布的CV777毒株的序列，將S基因分為S1和S2兩段，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。提取PEDV分離株的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(總體積為50 μL)：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，PEDV cDNA 3 μL，ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 150 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存2 h。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。按照產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)，純化目的條帶，進(jìn)行T載體克隆，得到重組陽(yáng)性質(zhì)粒，送擎科生物科技(武漢)有限公司測(cè)序。

表1 PEDV S基因的PCR擴(kuò)增引物

1.6 S基因的遺傳進(jìn)化與分析參照GenBank登錄的PEDV的代表性毒株以及我國(guó)近幾年流行毒株的S基因序列(表2)，運(yùn)用Mega Ⅹ繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，將HB2018株的S基因與不同時(shí)間不同地域分離的PEDV毒株進(jìn)行對(duì)比分析。同時(shí)，將S基因的氨基酸序列與商品化疫苗株(CV777、DR13、AJ1102和LW/L)進(jìn)行比對(duì)。

表2 PEDV參考毒株信息

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)10只26日齡斷奶仔豬用PEDV-IgG酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)仔豬的血清抗體為陰性。實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)分成接毒組(n=5)和陰性組(n=5)，每個(gè)試驗(yàn)組的豬被飼喂在P2動(dòng)物房。接毒組口服接種4 mL/只病毒液(TCID50為106.7/mL)，對(duì)照組口服接種相同劑量的DMEM培養(yǎng)基。接種豬和陰性對(duì)照豬在接種后每天觀測(cè)腹瀉情況，并采集直腸拭子進(jìn)行病毒RNA的檢測(cè)。在接種PEDV 6 d后，實(shí)施安樂(lè)死進(jìn)行病理檢查。腹瀉通過(guò)糞便稠度評(píng)分來(lái)評(píng)估。糞便稠度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0=固體；1=糊狀；2=半液態(tài)；3=液態(tài)，評(píng)分為2分或2分以上為腹瀉。

2 結(jié)果

2.1 樣品的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)多重RT-PCR檢測(cè)，17份腹瀉樣品中檢出PEDV陽(yáng)性樣品7份，約占41.18%，TGEV和 PRV陽(yáng)性樣品未檢出。結(jié)果表明，湖北地區(qū)的仔豬腹瀉病原主要為PEDV。

2.2 病毒的分離鑒定將PEDV陽(yáng)性病料接種至Vero細(xì)胞后，有1份陽(yáng)性病料能夠在Vero細(xì)胞上出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖1)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓消失、細(xì)胞融合拉網(wǎng)及細(xì)胞死亡脫落。經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，試驗(yàn)成功分離得到1株P(guān)EDV，命名為HB2018株。運(yùn)用Reed-Muench法計(jì)算HB2018分離株的病毒滴度為106.7TCID50/mL。

A.對(duì)照組；B.接毒組圖1 Vero細(xì)胞接毒結(jié)果

2.3 S基因的擴(kuò)增使用分離株基因組反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到S1和S2的目的條帶，長(zhǎng)度分別為2 208，1 953 bp(圖2)。送擎科生物科技(武漢)有限公司測(cè)序得到S1和S2的序列，拼接得到全長(zhǎng)為4 161 bp的S基因。

M.DL5000 DNA Marker；1.S1基因；2.S2基因圖2 S基因的分段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 S基因的遺傳進(jìn)化與分析將分離株S基因與NCBI上公布的典型序列進(jìn)行比對(duì)(圖3)。基于S基因繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)表明，PEDV毒株主要分為兩個(gè)大的分支，GⅠ分支主要包含早期和經(jīng)典PEDV毒株，而我國(guó)近幾年的PEDV流行株基本屬于GⅡ分支。HB2018株與我國(guó)近幾年流行的毒株處于同一分支，與經(jīng)典毒株CV777株等處于不同分支，同源性只有93.76%。HB2018株與我國(guó)近幾年的流行株一樣，均發(fā)生了明顯的變異。此外，HB2018株與YC2014株、CH/HNLH/2015株和AHCZ-2株同源性較近，同源性分別為99.25%，99.13%，99.23%。

圖3 PEDV分離株S基因的遺傳進(jìn)化分析

HB2018株與現(xiàn)有商品化疫苗株的S基因核苷酸和氨基酸進(jìn)行比對(duì)，同源性比對(duì)結(jié)果顯示，HB2018分離株與CV777和DR13(GⅠ亞群)的核苷酸同源性為93.76%和93.52%，與AJ1102和LW/L(GⅡ亞群)的核苷酸同源性為97.40%和97.00%(表3)。HB2018株與CV777和DR13(GⅠ亞群)的氨基酸同源性為93.44%和92.93%，與AJ1102和LW/L(GⅡ亞群)的氨基酸同源性為98.12%和96.90%(表3)。HB2018株與商品化疫苗株相比有11個(gè)氨基酸發(fā)生突變(表4)，這11個(gè)位點(diǎn)的突變與GⅠ、GⅡ亞群皆不相同，且與同屬于GⅡ亞群的疫苗株在1 199位有1個(gè)氨基酸的插入。

表3 HB2018分離株S基因核苷酸和氨基酸同源性分析 %

表4 HB2018分離株與疫苗株S基因關(guān)鍵氨基酸的突變位點(diǎn)

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)接種PEDV的斷奶仔豬中，接種后1 d出現(xiàn)輕微腹瀉，此后腹瀉癥狀加劇，在接種3 d時(shí)，斷奶仔豬腹瀉癥狀嚴(yán)重(所有評(píng)分均≥2)，隨后，仔豬癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)有出現(xiàn)陰性對(duì)照的斷奶仔豬出現(xiàn)腹瀉或其他臨床癥狀。在接種1～6 d，斷奶仔豬的糞便稠度評(píng)分先上升后下降(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)P<0.01)(圖4)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)斷奶仔豬的直腸拭子，接毒組的3頭仔豬在接種2 d檢測(cè)到病毒RNA，接種3～6 d，接毒組的斷奶仔豬均檢測(cè)到病毒RNA。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)有陰性對(duì)照豬的糞便中可檢測(cè)到病毒RNA(表5)。在安樂(lè)死的接種斷奶仔豬中沒(méi)有明顯的大體損傷。斷奶仔豬的組織學(xué)檢查顯示，小腸的腸壁變得薄而透明，并且在小腸腔中積聚了大量的液體(圖5)。陰性對(duì)照組的小腸及大腸等其他器官未見(jiàn)明顯組織學(xué)損傷。

腹瀉通過(guò)糞便稠度評(píng)分來(lái)評(píng)估。糞便稠度評(píng)分如下：0=固體；1=糊狀；2=半液態(tài)；3=液態(tài)，評(píng)分為2分或2分以上為腹瀉。每個(gè)數(shù)值為5頭斷奶仔豬的平均值圖4 斷奶仔豬糞便稠度評(píng)分

表5 斷奶仔豬直腸拭子病毒RNA檢測(cè)

3 討論

本研究分離獲得1株命名為HB2018的PEDV毒株，擴(kuò)增其S基因，并分析S基因核苷酸和氨基酸的同源性。根據(jù)GUO等[9]的分型依據(jù)，HB2018株屬于GⅡa亞群，與CV777等經(jīng)典毒株的同源較低，僅為93.76%，處于不同的分支，與2011年以后我國(guó)分離報(bào)道的PEDV變異株(GⅡ亞群)處于同一分支，但與AJ1102、LW/L等GⅡ亞群的疫苗株相比，分離株HB2018依然處在不同分支，PEDV依然存在繼續(xù)變異的潛在風(fēng)險(xiǎn)。氨基酸同源性分析顯示，PEDV與現(xiàn)有的商品化疫苗株有較大差異，PEDV正在出現(xiàn)新的變異。由此可見(jiàn)，近幾年我國(guó)的PEDV依舊處于不斷地變異中，需要與流行株相匹配的疫苗株，研究HB2018分離株的特性，將為PEDV疫情的控制提供技術(shù)儲(chǔ)備。

通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)可知，分離株HB2018口服感染斷奶仔豬，仔豬均出現(xiàn)腹瀉癥狀，隨后好轉(zhuǎn)，但直腸拭子中可以檢測(cè)到PEDV 的RNA，組織學(xué)檢測(cè)小腸出現(xiàn)病變，由此可知，PEDV引起哺乳仔豬死亡主要為小腸損傷，脫水致死，結(jié)果與JUNG等[1]的研究相一致。此外，有研究對(duì)不同日齡仔豬進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，也證實(shí)了PEDV可引起仔豬小腸的組織學(xué)病變[10-11]。LIU等[12]測(cè)定直腸拭子PEDV RNA滴度的結(jié)果，與本研究中仔豬排毒的時(shí)間一致。

全球范圍內(nèi)廣泛流行的PEDV流行株與經(jīng)典株及疫苗株的基因序列發(fā)生了很大程度的變異，其S基因核苷酸序列與報(bào)道的PEDV流行株與經(jīng)典株出現(xiàn)了較大的差異。原因是冠狀病毒基因組為單股正鏈的RNA病毒，穩(wěn)定性較差，易發(fā)生突變。2010年以來(lái)，我國(guó)暴發(fā)的大規(guī)模PEDV感染疫情是PEDV發(fā)生了較大變異所導(dǎo)致。王婧怡等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)原種豬場(chǎng)的PEDV血清陽(yáng)性值較高，PEDV的疫情依然嚴(yán)峻。此外，PEDV還在變異，這種變異可能對(duì)PEDV的防控提出新的挑戰(zhàn)，需加強(qiáng)該病原的流行病學(xué)研究，密切關(guān)注病原的遺傳變異。因此，研究當(dāng)前PEDV主要流行株為防控PED的發(fā)生有重要的意義。