豬圓環(huán)病毒3型和4型雙重PCR檢測方法的建立

侯承堯， 徐 通,崔建濤,田潤博,鄭蘭蘭，趙 麗，陳紅英* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 45000；.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV) 屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種無囊膜、二十面體對稱的單股環(huán)狀DNA病毒，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒之一[1]。根據(jù)最新報道PCV可以分為PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[2-3]。PCV1對豬沒有致病性[4]，而PCV2被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原[5]，不僅可引起PMWS，還與豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病(PRDC)、母豬繁殖障礙、增生性壞死性腸炎等疾病密切相關(guān)[6]。2015年,美國學(xué)者PALINSKI等[7]和PHAN等[8]發(fā)現(xiàn)PCV3，隨后在中國、韓國和意大利等國家相繼報道[9-11]。目前PCV3已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行，據(jù)相關(guān)報道PCV3極可能會導(dǎo)致PNDS、PRDC和繁殖障礙等一系列PCV相關(guān)疾病(PCVAD)[12]。2019年,ZHANG等[3]在湖南省發(fā)現(xiàn)新型PCV，并暫定為PCV4型。PCV4全長為1 770 bp，和其他PCV的同源性為43.2%～51.5%，也包含2個主要的開放閱讀框Rep和Cap，且發(fā)現(xiàn)PCV4可能與PDNS和PRDC等嚴(yán)重臨床疾病相關(guān)。

前期研究結(jié)果顯示，PCV3/4均與PDNS、PRDC相關(guān)，且兩者的混合感染在我國豬場已經(jīng)存在，臨床診斷難于區(qū)分這2種病原體，因此需要建立實驗室診斷方法。徐朋麗等[13]、田潤博等[14]已經(jīng)建立了針對PCV3/4單項PCR檢測方法，迄今尚無同時檢測和區(qū)分PCV3/4的PCR檢測方法，且單項的PCR檢測方法費(fèi)時費(fèi)力。因此，本研究旨在建立一種同時檢測PCV3/4的雙重PCR方法，并對河南、山西省部分地區(qū)臨床病料進(jìn)行檢測，為這2種病原的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株及臨床樣品根據(jù)徐朋麗等[13]、田潤博等[14]建立的PCR方法，對實驗室保存的疑似PCV感染病料樣品分別進(jìn)行PCV3/4檢測、測序，將鑒定為陽性的病料樣品用于本試驗陽性對照和重組質(zhì)粒的構(gòu)建。PCV2、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)均由鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室保存。

2018—2020年采自河南和山西省部分豬場疑似PCV感染的72份豬組織及血清樣本，經(jīng)處理后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑UNIQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；2×Fast Taq Premix 酶、DNA MarkerⅠ、DH5α感受態(tài)和微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成利用DNAStar軟件MegAlign程序，對GenBank中已發(fā)表的PCV3全基因及其Rep基因序列(MF593110、MH192341、KX966193 KY075989、KY996341、LC383840、MF162298、MH699985、MH607133)，PCV4 Cap基因(MN162710) 及其全基因序列(MK986820)進(jìn)行比對分析，確定PCV3 Rep基因和PCV4 Cap基因的高度保守區(qū)域，利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計1對特異性引物(P1/P2、P3/P4)，預(yù)期擴(kuò)增片段為138，391 bp。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。

表1 雙重PCR引物信息

1.4 病毒核酸的提取利用UNIQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒提取PCV2、PRV和PPV以及PCV3/4陽性病料樣品的基因組DNA，—80℃保存；利用TRIzol法提取PEDV、PRRSV和CSFV的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存。

1.5 單項PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆與測序以1.4中提取的PCV3/4基因組DNA為模板，用P1/P2、P3/P4 2對特異性引物分別進(jìn)行PCV3/4的單項PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為25 μL：2×Fast Taq Premix 酶 12.5 μL，上、下游引物各為0.5 μL，模板量為3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCV3的反應(yīng)程序為95℃ 5 min；95℃ 25 s、58℃ 25 s、72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCV4的反應(yīng)程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，經(jīng)紫外分光光度計測量重組質(zhì)粒的濃度，并計算其拷貝數(shù)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCV3/4雙重PCR方法的建立

1.6.1雙重PCR方法條件的優(yōu)化 在PCV3/4單項PCR方法的基礎(chǔ)上，采用方陣試驗分別針對退火溫度(52～62℃)和時間(20～45 s)、循環(huán)數(shù)(20～40)、引物比例、模板量對雙重PCR方法進(jìn)行條件優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.6.2雙重PCR方法的特異性試驗 利用已優(yōu)化的雙重PCR方法，分別對PCV2、PRV、PPV、 PEDV、PRRSV和CSFV核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)立陰性對照，評價建立的雙重PCR方法的特異性。

1.6.3雙重PCR方法的敏感性試驗 將重組質(zhì)粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4等體積混合，進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)后，取混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒1 μL 做模板，利用已優(yōu)化的雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時設(shè)立陰性對照，評價建立的雙重PCR方法的敏感性。

1.6.4雙重PCR方法的重復(fù)性試驗 隨機(jī)取3份已知的PCV3 和PCV4混合感染的陽性病料樣品DNA為模板，利用已優(yōu)化的雙重PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次。間隔1周后再利用此方法檢測，共重復(fù)3次，從而評價建立的雙重PCR方法的重復(fù)性。

1.7 臨床樣品檢測利用已優(yōu)化的雙重PCR方法對2018—2020年收集自河南和山西部分地區(qū)豬場疑似PCV感染的72份豬組織病料樣品進(jìn)行檢測，并與單項PCR檢測結(jié)果進(jìn)行對比，評價該雙重方法的準(zhǔn)確性和臨床實用性。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR擴(kuò)增結(jié)果利用P1/P2、P3/P4 2對特異性引物，分別對PCV3、PCV4陽性病料樣品DNA進(jìn)行單項PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別出現(xiàn)大小約130 bp(PCV3)和390 bp(PCV4)的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。測序結(jié)果顯示，克隆的PCV3片段大小為138 bp，與參考序列(MF593110、KY996341)同源性為98.6%～100.0%；PCV4片段大小為391 bp，與參考序列(MN162710、MK986820)同源性為100.0%；表明單項PCR擴(kuò)增結(jié)果是特異的。

2.2 雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果及優(yōu)化通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系為25 μL：2×Fast Taq Premix 酶 12.5 μL，P1/P2各0.6 μL、P3/P4各0.4 μL，模板量為2 μL，ddH2O 8.5 μL。最佳反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共35個循環(huán)。利用已優(yōu)化的雙重PCR方法，對PCV3/4陽性病料樣品的混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，雙重PCR方法能同時擴(kuò)增138 bp(PCV3)和391 bp(PCV4)的2條特異性目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，且與2個單項PCR擴(kuò)增條帶相一致。

M.DL1000 DNA Marker;1.PCV3/4雙重PCR產(chǎn)物;2.PCV3單項PCR產(chǎn)物;3.PCV4單項PCR產(chǎn)物;4.陰性對照圖1 PCV3/4單項及雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 雙重PCR方法的特異性試驗運(yùn)用建立的雙重PCR方法，分別針對PCV3/4混合DNA、PCV2、PRV、PPV的DNA和PEDV、PRRSV、CSFV的cDNA模板及陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，僅當(dāng)PCV3/4混合DNA為模板時，可以有效地擴(kuò)增出2條特異條帶(PCV3的138 bp和PCV4的391 bp)，而以5種常見豬源病毒核酸和陰性對照為模板，無特異性擴(kuò)增片段(圖2)，表明建立的雙重PCR方法具有良好的特異性。

M.DL1000 DNA Marker;1.PCV3、PCV4雙重 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物;2～7.PCV2、PRV、PPV、PEDV、PRRSV、CSFV擴(kuò)增產(chǎn)物;8.陰性對照圖2 PCV3/4雙重PCR特異性試驗

2.4 雙重PCR方法的敏感性試驗將測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度計測量質(zhì)量濃度，pMD18-PCV3為231 mg/L(約7.45×1010拷貝/μL)和pMD18-PCV4為305 mg/L(約9.02×1010拷貝/μL)。

將重組質(zhì)粒pMD18-PCV3和pMD18-PCV4等體積混合，進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，利用雙重PCR方法對其進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該雙重方法對pMD18-PCV3和pMD18-PCV4的檢測極限均到10-9稀釋度，PCV3最低檢測極限為74.5拷貝/μL，PCV4最低檢測極限為90.2拷貝/μL(圖3)。

M.DL1000 DNA Marker;1～10.PCV3和PCV4質(zhì)粒混合后10-1～10-10倍比稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物；11.陰性對照圖3 雙重PCR敏感性試驗

2.5 雙重PCR方法的重復(fù)性試驗利用雙重PCR方法對隨機(jī)選取的PCV3、PCV4混合感染的病料DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并重復(fù)3次。隨后每間隔1周檢測1次，共重復(fù)3次。結(jié)果顯示，均能成功擴(kuò)增出PCV3/4預(yù)期的特異目的片段且陰性對照正常，表明建立的雙重PCR方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果采用已優(yōu)化的雙重PCR方法，對實驗室2018—2020年采集的臨床疑似PCV感染的72份病料樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示， PCV3的檢出率為58.3%(42/72)； PCV4的檢出率為19.4%(14/72)；同時感染PCV3/4的檢出率為19.4%(14/72)。雙重PCR方法的檢測結(jié)果與單重PCR方法檢測結(jié)果符合率為100.0%(表2),表明建立的雙重PCR方法準(zhǔn)確可靠，可以用于臨床檢測。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果 份

3 討論

PCV3/4均為近年新發(fā)現(xiàn)的PCV基因型，兩者都可能引起PDNS、PRDC的感染，在臨床致病方面還有許多問題亟需深入研究，因此對PCV3/4的檢測和監(jiān)測就顯得尤為重要。田潤博等[14]已建立了針對PCV4單項的普通PCR檢測方法，并且發(fā)現(xiàn)廣泛存在PCV3/4的混合感染。ZHANG等[15]研究也發(fā)現(xiàn)PCV3/4混合感染的病例。針對PCV4，除了單項普通PCR檢測方法以外，ZHANG等[3]建立TaqMan熒光定量PCR檢測方法，ZHANG等[15]建立SYBR Green 熒光定量PCR檢測方法，此方法雖方便快捷、靈敏度高，但成本也較高，不適用于臨床上大批量樣本的檢測和監(jiān)控，且在臨床上無法區(qū)分PCV3/4。PCV3/4的單項PCR方法進(jìn)行檢測，費(fèi)時費(fèi)力且成本高，而雙重PCR技術(shù)能夠節(jié)約成本同時快速檢測2種病原。

本研究根據(jù)GenBank登錄的PCV3/4基因序列，設(shè)計了2對特異性引物。引物濃度均為25 μmol/L，因P1/P2引物擴(kuò)增效率較低，將PCV3/4引物P1/P2和P3/P4的比例調(diào)整為6∶4，再對退火溫度及時間等進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時檢測PCV3/4的雙重PCR。最終確定同時檢測PCV3/4的雙重PCR最佳條件為：P1/P2各0.6 μL，P3/P4各0.4 μL，退火溫度55℃，退火時間30 s，循環(huán)次數(shù)35個循環(huán)。特異性試驗結(jié)果表明，僅PCV3/4 混合DNA能夠擴(kuò)增出2個片段，而對PCV2、PRV、PPV、PEDV、PRRSV和CSFV核酸均無特異性擴(kuò)增。PCV3/4的檢測極限分別為74.5，90.2 拷貝/μL，略低于XU等[16]建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法對PCV3的檢測極限為21.9拷貝/μL，和ZHANG等[15]建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法對PCV4的檢測極限為30 拷貝/μL，與徐朋麗等[13]建立的PCV3普通PCR方法和田潤博等[14]建立的PCV4普通PCR方法檢測極限相當(dāng)，高于季程遠(yuǎn)等[17]PCV3檢測極限。表明本試驗建立的雙重PCR方法特異性強(qiáng)和靈敏度高。因此該方法對PCV3/4的臨床檢測和鑒別診斷有一定的應(yīng)用價值。

采用建立的PCV3/4雙重PCR方法，對2018—2020年河南和山西部分地區(qū)的72份疑似PCV病料樣品進(jìn)行檢測，PCV3檢出率為58.3%，PCV4檢出率為19.4%，兩者混合感染的檢出率為19.4%。XU等[16]報道河南地區(qū)PCV3陽性率為31.2%，WANG等[18]報道天津地區(qū)PCV3陽性率為37.3%，CHEN等[19]對廣東省和廣西省的203份病料進(jìn)行檢測，PCV3陽性率高達(dá)86.7%。ZHANG等[3]對2017年10月至2019年5月湖南省187份臨床樣品進(jìn)行檢測，PCV4陽性率為12.8%；ZHANG等[15]對2019年安徽省168份樣品進(jìn)行檢測，PCV4陽性率為10.7%；此外，CHEN等[20]在江蘇省也發(fā)現(xiàn)PCV4。綜上所述，PCV3陽性率呈逐年升高趨勢，PCV4已在我國大部分地區(qū)流行，使養(yǎng)豬業(yè)面臨著新的挑戰(zhàn)，提示應(yīng)加強(qiáng)對PCV3和PCV4的臨床診斷和監(jiān)測。