N-myc表達(dá)在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤完全緩解后復(fù)發(fā)中的作用*

李凡 張偉令 胡慧敏 張誼 陳莉萍 文圓 杜旭艷 黃東生

作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院兒科（北京市100730）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期最常見的顱外實(shí)體瘤，占15 歲以下兒童所有腫瘤的7%，占所有因癌癥死亡兒童的15%[1]。近年來，隨著手術(shù)、化療、放療以及干細(xì)胞移植等綜合治療的開展，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒經(jīng)治療后的完全緩解率及5年生存率均顯著提高。但仍有約50% 的高危患兒在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)通常伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或新發(fā)病灶，患兒的病死率也隨之顯著增加[3-5]。

目前，多項(xiàng)研究表明[6-8]，MYCN 基因的擴(kuò)增與N-myc 蛋白表達(dá)的增加是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒預(yù)后不良的重要因素。N-myc 蛋白是原癌基因MYCN編碼的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白，其通過與同源的靶基因啟動(dòng)子相結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、代謝、凋亡及分化[9]。由于導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制與一般預(yù)后不良的機(jī)制相同，但尚未明確N-myc 蛋白表達(dá)是否在神經(jīng)母細(xì)胞瘤緩解后復(fù)發(fā)中發(fā)揮的作用。本研究通過對(duì)治療后達(dá)到完全緩解的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒進(jìn)行回顧性分析，探討N-myc 蛋白表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤完全緩解后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究為回顧性隊(duì)列研究，選取2005年8月至2018年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為神經(jīng)母細(xì)胞瘤且達(dá)到初次完全緩解標(biāo)準(zhǔn)的患兒121 例，其中49 例腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)法測(cè)定N-myc 蛋白表達(dá)，并被納入本研究。其中男性28 例，女性21 例。根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)（INSS）[10]，分為2 期4 例，3 期18 例，4 期23 例，4S 期4 例。原發(fā)病灶部位：位于腎上腺或腹膜后39 例，縱隔8 例，盆腔2 例。根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理分類標(biāo)準(zhǔn)（INPC）[11]，分為神經(jīng)母細(xì)胞瘤25 例，節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤（結(jié)節(jié)型）18 例，節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤（混雜型）6 例。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患兒家屬知情同意。平均隨訪時(shí)間（58.35±3.10）個(gè)月，中位隨訪時(shí)間（59.00±4.92）個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 N-myc 蛋白表達(dá)檢測(cè)方法及陽性的判定標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組織化學(xué)法對(duì)患兒的腫瘤病理組織標(biāo)本進(jìn)行N-myc 蛋白表達(dá)檢測(cè)。病理組織切片經(jīng)固定封閉處理，加入抗N-myc 鼠單克隆抗體（購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）及顯色劑，經(jīng)PBS 緩沖液沖洗，再加入HRP 標(biāo)記抗人IgG 第二抗體（購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），經(jīng)PBS 緩沖液沖洗后蘇木精復(fù)染，乙醇脫水干燥。檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：切片無染色細(xì)胞，結(jié)果判定為陰性；切片呈局灶狀、散在狀或弱染色，結(jié)果判定為弱陽性；切片呈彌漫性強(qiáng)染色或呈典型不均勻強(qiáng)化，結(jié)果判定為陽性。結(jié)果判定常規(guī)設(shè)置陽性對(duì)照及空白對(duì)照。

1.2.2 治療方案 所有患兒均行手術(shù)、化療和放療。根據(jù)國(guó)際兒童腫瘤組（COG）原則并結(jié)合難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤個(gè)體化治療方案，低、中危組患兒的化療方案包括卡鉑+依托泊苷（CBVP）、環(huán)磷酰胺+吡柔比星+長(zhǎng)春新堿（CTX+THP+VCR），高危組患兒的化療方案包括環(huán)磷酰胺+吡柔比星+長(zhǎng)春新堿（CDV）、順鉑+依托泊苷（CiE）、拓?fù)涮婵?環(huán)磷酰胺（TOPO+CTX）、順鉑+依托泊苷+吡柔比星+環(huán)磷酰胺（PECA）等。術(shù)前化療2～6 個(gè)周期，術(shù)后化療4～10 個(gè)周期，總化療周期一般不超過16 個(gè)周期。腫瘤切除手術(shù)均在合作醫(yī)院進(jìn)行。低、中危組患兒的治療方案以化療聯(lián)合瘤灶完全切除手術(shù)為主，高危組患兒則以化療、放療、瘤灶部分切除手術(shù)以及造血干細(xì)胞移植的綜合治療為主。輔助治療包括使用阿米福汀降低化療藥物的不良反應(yīng)、靜脈營(yíng)養(yǎng)支持、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持治療等。

1.2.3 腫瘤完全緩解及復(fù)發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn) 按照國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤反應(yīng)分級(jí)（INRC）及腫瘤報(bào)告評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[12]。完全緩解是指所有原發(fā)和轉(zhuǎn)移性病變完全消失，并至少維持4 周以上。腫瘤復(fù)發(fā)指患兒達(dá)到初次完全緩解后，在規(guī)律隨訪期間出現(xiàn)新發(fā)病灶。無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）是指從初次完全緩解到復(fù)發(fā)或最后1 次隨訪的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)變量采用均值或中位數(shù)表示，分類變量采用頻率和百分比表示。正態(tài)分布連續(xù)變量比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn)，單因素分析采用Kaplan-Meier 法，單因素間差異比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。采用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估危險(xiǎn)因素與腫瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。Cox 回歸模型采用正向LR 法篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

根據(jù)N-myc 免疫組織化學(xué)結(jié)果將患兒分為兩組，其中N-myc 蛋白表達(dá)陽性組27 例，N-myc 蛋白表達(dá)陰性組（對(duì)照組）22 例（圖1）。本研究無N-myc 表達(dá)弱陽性病例。兩組患兒的年齡比較[（2.675±2.118）歲vs.（3.148±2.265）歲]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.753，P=0.455）。兩組患兒性別、INSS 分期比較，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。兩組患兒病理類型、原發(fā)病灶部位的比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織N-myc 蛋白表達(dá)（ABC 法×200）

2.2 總生存率的比較

49 例完全緩解神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的1、3、5年總生存率分別為100.0%、85.6% 和75.7%。N-myc 蛋白表達(dá)陽性組患兒的1、3、5年總生存率分別為100.0%、77.4% 和64.2%，對(duì)照組分別為100.0%、95.5%和90.9%。本研究結(jié)果表明，N-myc 蛋白表達(dá)陽性組患兒的總生存率顯著低于對(duì)照組（χ2=3.931，P=0.047，圖2）。

圖2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤完全緩解患兒的總生存曲線

2.3 RFS 率的比較

49 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒完全緩解后的1、3、5年RFS 率分別為87.8%、67.3%和65.0%。N-myc 蛋白表達(dá)陽性組患兒的1、3、5年RFS 率分別為81.5%、55.6%和51.6%，對(duì)照組分別為95.5%、81.8%和81.8%。結(jié)果表明，N-myc 蛋白表達(dá)陽性組患兒的RFS 率顯著低于對(duì)照組（x2=4.719，P=0.030，圖3）。

圖3 神經(jīng)母細(xì)胞瘤完全緩解患兒的RFS 曲線

2.4 單因素及多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，N-myc 蛋白陽性組與對(duì)照組在病理類型、原發(fā)病灶部位均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。為進(jìn)一步去除混雜因素對(duì)結(jié)果的影響，將年齡、性別、INSS 分期、病理類型、原發(fā)病灶部位、N-myc 蛋白全部納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行變量篩選與剔除，以評(píng)估影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤完全緩解后復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素。結(jié)果提示，N-myc 蛋白表達(dá)陽性是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒完全緩解后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（95%CI：1.038～9.783，P=0.043），Nmyc 蛋白陽性的患兒在經(jīng)過治療達(dá)到完全緩解后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)是N-myc 蛋白陰性患兒的3.187 倍。年齡、性別、INSS 分期、病理類型及原發(fā)病灶部位并非是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療后復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素（均P＞0.05）。

3 討論

近年來，隨著對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后因素的深入研究，采用臨床特征與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估已達(dá)成共識(shí)。目前，普遍認(rèn)為年齡、INSS 分期、MYCN 基因擴(kuò)增、組織病理類型等因素與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后密切相關(guān)。COG 根據(jù)年齡、INSS 分期、MYCN 狀態(tài)、DNA 拷貝數(shù)（倍體）和組織學(xué)特征，將患兒分為低、中、高3個(gè)不同的風(fēng)險(xiǎn)類別，每級(jí)風(fēng)險(xiǎn)類別分別提示不同的無事件生存率及總生存率[13]。近年來，國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤風(fēng)險(xiǎn)分組（INRG）提出的分類標(biāo)準(zhǔn)采用了類似的方法用于評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后[14]。雖然目前已經(jīng)建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤總體預(yù)后的分層評(píng)估方法，但關(guān)于如何預(yù)測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤在經(jīng)過治療達(dá)到完全緩解后的復(fù)發(fā)概率以及如何有效防止腫瘤治療后復(fù)發(fā)，尚無系統(tǒng)性的研究。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒治療后復(fù)發(fā)的概率遠(yuǎn)高于其他惡性實(shí)體腫瘤，高危組患兒總體復(fù)發(fā)率高達(dá)50%。近年來，隨著手術(shù)、化療、放療和造血干細(xì)胞移植等綜合治療的開展以及化療方案的改進(jìn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒經(jīng)過治療后的緩解率已顯著提升。盡管如此，患兒在完全緩解后的復(fù)發(fā)概率仍較高。一旦出現(xiàn)緩解后復(fù)發(fā)，需要進(jìn)行挽救性治療。目前，挽救性治療方案尚無統(tǒng)一共識(shí)，治療方法主要包括化療、骨髓造血干細(xì)胞移植、間碘芐胍（metaiodobenzylguanidine，MIBG）治療、抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療等。挽救性治療在低危、中危組且局部復(fù)發(fā)的病例中療效較好[15]。對(duì)于高危組患者，尤其是伴隨多灶性轉(zhuǎn)移的病例，治療效果較差，復(fù)發(fā)后中位生存期僅11 個(gè)月[16]，5年總生存率僅20%[17]。由于導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤緩解后復(fù)發(fā)的機(jī)制可能有別于一般預(yù)后不良的機(jī)制，因此復(fù)發(fā)因素也應(yīng)區(qū)別于一般的預(yù)后因素研究而單獨(dú)進(jìn)行分析。

本研究通過對(duì)49 例經(jīng)綜合治療達(dá)到完全緩解標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)N-myc蛋白表達(dá)陽性患兒的總生存率及RFS 率均顯著低于N-myc 蛋白表達(dá)陰性的患兒，且N-myc 蛋白表達(dá)陽性的患兒在完全緩解后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)是N-myc 蛋白陰性患兒的3.187 倍。與此同時(shí)，通過多因素回歸分析模型對(duì)變量進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、INSS 分期、病理類型及原發(fā)病灶部位等并非是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療后復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素（均P＞0.05）。雖然本研究發(fā)現(xiàn)N-myc 蛋白表達(dá)是導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，但由于缺少M(fèi)YCN 基因擴(kuò)增資料，尚無法準(zhǔn)確推斷MYCN 基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄水平與神經(jīng)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)之間是否存在必然聯(lián)系。雖有研究表明[18]，MYCN 基因擴(kuò)增與N-myc 蛋白的表達(dá)有良好的相關(guān)性，但仍需進(jìn)一步研究以明確MYCN 基因擴(kuò)增在神經(jīng)母細(xì)胞瘤緩解后復(fù)發(fā)中的作用。后續(xù)研究需擴(kuò)充樣本量，并通過建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停剿鱊-myc在腫瘤復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制，以進(jìn)一步明確MYCN 基因擴(kuò)增與表達(dá)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤緩解后復(fù)發(fā)中的作用。

綜上所述，N-myc 蛋白表達(dá)是影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒完全緩解后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素之一。由于N-myc蛋白表達(dá)在腫瘤緩解后的復(fù)發(fā)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，即使N-myc 蛋白表達(dá)陽性的初治患兒在經(jīng)過綜合治療后可以獲得完全緩解，其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及病死率依然顯著高于N-myc 蛋白表達(dá)陰性的患兒。因此，對(duì)于Nmyc 蛋白表達(dá)陽性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒，臨床醫(yī)師需要更加重視對(duì)初始治療方案的調(diào)整、完全緩解后的鞏固治療以及加強(qiáng)腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，從而最大限度避免神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療后復(fù)發(fā)，以改善患兒長(zhǎng)期預(yù)后。