兒童急性橫貫性脊髓炎的潛在治療靶點實驗研究

師 洋，王志杰，王天儀

目前，急性橫貫性脊髓炎(acute transverse myelitis, ATM)臨床仍然缺乏行之有效的治療方法。兒童時期是ATM患者發病率較高的階段之一[1]。ATM患者存在暫時或永久性運動、感覺和自主神經功能障礙，約33%的患者遺留嚴重感覺功能異常[2]。基質金屬蛋白酶(MMP)在基底膜降解過程中起作用，可以引起血腦屏障破壞，并在炎癥過程中發揮重要作用。有研究報道中樞神經系統損傷后神經元自身表達的MMP-9上調[3-4]。Cardone等[5]研究發現MMP-9的過表達可直接影響神經元生長狀態。Gu等[6]報道，在體外培養神經元中加入活化的MMP-9可改變其生長狀態，而加入MMP-9抑制劑后可減少神經元凋亡。Asahi等[7]報道MMP-9能夠特異性地降解髓鞘堿性蛋白(MBP)，以致廣泛的脫髓鞘和生長錐崩解進而導致中樞神經傳導功能損傷。MicroRNA(miRNA)是可以在轉錄后水平調控基因表達的非編碼RNA，其與生物體的遺傳性狀、生長發育和疾病的發生發展有密切的關系[8]。miRNA組學(miRNomes)能夠同時觀察在某個生命現象中全部已知關鍵miRNA發生的變化及其對靶基因組的動態表達調控過程[9]。本研究旨在運用miRNomes的方法以系統的、全局的視角去探尋兒童ATM關鍵調控機制，并尋找精準、高效的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2019年6月在承德醫學院附屬醫院和解放軍聯勤保障部隊第九八一醫院診斷為ATM的患兒4例為觀察組，臨床懷疑相關疾病且經腦脊液等相關檢查排除疾病后腦脊液正常的患兒3例為對照組。納入標準：觀察組均符合2002年橫貫性脊髓炎聯盟工作組織(TMCWG)提出的診斷標準，年齡<14歲。2組患兒監護人簽署知情同意書。排除標準：觀察組為除ATM外其他疾病者；近期曾患感染性疾病者；有家族遺傳病史者；有結核病史者；生長發育遲緩、營養不良者。對照組近期曾患感染性疾病者；有家族遺傳病史者；有結核病史者；生長發育遲緩、營養不良者。

1.2樣本采集和總RNA提取 2組均取腦脊液，并將觀察組腦脊液樣本隨機編號T1、T2、T3、T4，隨后凍存。生物信息分析試驗部分將對照組樣本進行混樣操作。本研究通過我院醫學倫理委員會審批，項目編號為201606A062。根據說明書中的操作步驟，使用mirVanaTMPARISTMKit試劑盒(Ambion，美國)提取總RNA。每例樣本取2 ml，迅速轉入抗凝管中用移液器混勻。在室溫下1 h內進行以下步驟：4 ℃條件下820×g離心10 min。取1 ml上清液放入無菌的1.5 ml離心管中離心，4 ℃，16 000×g，共10 min。將上清液移至干凈的離心管中，并保存在-80 ℃下備用。取400 μl樣本加入等量的2×Denaturing Solution渦旋混勻，放置于冰上，5 min后加入相同體積的氯仿，渦旋混勻(30～60 s)后室溫下離心，最高轉速，共5 min。取上清加入1.25倍體積的無水乙醇渦旋混勻。將其移至最大體積為700 μl的純化柱中離心，13 000×g，共30 s。向離心柱中加入350 μl 的miRNA Wash Solution 1，室溫下離心，13 000×g，共15 s，棄流過液，將離心柱放回收集管中。將10 μl DNase Ⅰ和 70 μl Buffer RDD QIAGEN混合，加入離心柱中的膜上于室溫放置，共15 min。向離心柱中加入350 μl miRNA Wash Solution 1，室溫下離心，13 000×g，共15 s，棄流過液，將離心柱重新放入收集管中。500 μl的 Wash Solution 2/3清洗純化柱2次，空柱離心1 min。將離心柱放在新的收集管中，加入100 μl 在95 ℃條件下預熱的Elution Solution，室溫下離心，最高轉速，共20～30 s，收集管中的液體即所提取的總RNA，在-70 ℃冰箱保存。

1.3miRNA表達譜數據分析 采用miRNA 4.0芯片(Affymetrix，美國)分析發生改變的miRNA。總RNA定量及完整性分別利用NanoDrop ND-2100(Thermo Scientific，美國)和Agilent 2100(Agilent，美國)檢測。確定樣品可用后依據芯片標準方案，對樣本標記、芯片雜交和洗脫。原始圖像用Affymetrix Scanner 3000(Affymetrix，美國)掃描獲得，應用Expression Console version1.3.1(Affymetrix，美國)數據分析軟件分析。將原始數據進行RMA標準化算法處理，獲得標準化后的表達譜數據。利用分層聚類分析法對樣本間差異表達的miRNA進行分析。

1.4miRNA的表達量檢測 應用miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit (Qiagen,德國)，采用RT-qPCR檢測miRNA的表達量，以U6作為miRNA表達的內參。應用PrimerScript RT reagent Kit (TaKaRa,日本)檢測miRNA的表達量，以GADPH作為miRNA表達的內參。

1.5MMP-9蛋白水平檢測 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)嚴格按照說明書操作步驟，使用美國R&D System公司生產的試劑盒檢測MMP-9基因蛋白水平。Western blot檢測細胞中MMP-9表達水平：將各樣本置入RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑后離心分離。分離蛋白樣品轉至硝酸纖維素膜。封膜后加入抗體，而后用ECL發光試劑檢測。

1.6細胞培養及轉染 在無菌條件下，取出新生Wistar大鼠背根神經節(DRG)放入D/F12+10%胎牛血清培養基中，放入24孔板，待神經元貼壁后更換為Neurobasal+B27培養基，培養3 d后進行實驗。實驗分為空白組、擴增亂序組、抑制亂序組、miR-133過表達組、miR-133抑制組。將miR-133b模擬物(miR-133b mimics)與抑制物(miR-133b inhibitor，GenePharma,中國)參照說明書流程進行轉染(YIJUN，中國)。

2 結果

2.1兒童ATM MicroRNA表達譜分析 與對照組比較，觀察組樣本中發生表達變化的miRNA共有681個。見圖1A。與對照組比較，T1～T4 miR-133b在各樣本中明顯下調，信號值分別為1.41、2.71、2.63、2.68。根據同一聚類miRNA可能具有相似生物學功能的理論[8]，本實驗聚類分析結果顯示T1～T4樣本中miR-133b表達變化被聚為一類，執行與健康對照樣本不同的生物學功能。見圖1B。因此本研究的治療靶點為miR-133b。RT-qPCR驗證miR-133b表達和基因芯片結果一致。見圖1C。

圖1 各組腦脊液樣本中microRNA表達譜分析A.橫列為microRNA的表達差異(縱列為不同樣本，藍色為下調，黃色為上調，上方顏色標尺為其余顏色所代表的變化)；B.miR-133b在各樣本中表達的聚類分析(藍色為下調，紅色為上調，上方顏色標尺為其余顏色所代表的變化)；C.RT-qPCR檢測的各樣本miR-133b相對表達量

2.2miR-133b靶基因預測 應用Target Scan數據庫以及查閱相關文獻預測出MMP-9為miR-133b的靶基因[10]，進而探究miR-133b表達變化的意義。MMP-9 3' UTR的第43～49位點:5' ...UGUAAAUCCCCACUGGGACCAAC..., hsa-miR-133b:3' AUCGACCAACUUCCCCUGGUUU。

2.3MMP-9蛋白表達 對照組MMP-9為237.24 μg/L，觀察組T1～T4分別為663.15、389.00、420.71、409.91 μg/L。與對照組比較，觀察組腦脊液樣本中MMP-9蛋白表達明顯上調(P<0.05)，其表達趨勢與miR-133b相反。見圖2。

圖2 觀察組T1～T4與對照組MMP-9蛋白與miR-133b表達水平比較MMP-9為基質金屬蛋白酶-9

2.4miR-133b通過MMP-9影響背根神經節神經元軸突生長 與空白組比較，miR-133b過表達組背根神經節神經元生長狀態相對較好，軸突明顯延長(P<0.05)。miR-133b抑制組背根神經節神經元軸突生長明顯弱于空白組(P<0.05)。見圖3A、3B。與空白組比較，miR-133b過表達組中MMP-9蛋白表達明顯下調，miR-133b抑制組中MMP-9蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖3C。

圖3 5組背根神經節神經元中miR-133b與MMP-9蛋白及軸突生長的關系A．背根神經節神經元生長狀態(免疫熒光×200)，紅色為用NF-200標識的背根神經節神經元，藍色為DAPI；B.背根神經節神經元軸突生長情況；C.MMP-9蛋白表達水平；MMP-9為基質金屬蛋白酶-9；與空白組比較，aP<0.05

3 討論

ATM是橫貫性脊髓炎的炎癥亞型，在疾病發作后的急性期和亞急性期會出現脊髓損害臨床癥狀，導致神經傳導障礙。目前ATM的發病機制仍難以明確[11]。兒童時期是ATM發病率最高的時期之一。本實驗應用microarray 4.0芯片檢測相較于健康兒童樣本而言在ATM樣本發生差異表達的microRNA，以期尋找在ATM疾病中發生作用的關鍵調控機制。miR-133b在ATM樣本中明顯下調，因此初步將該miRNA納入研究。

本研究應用Target scan數據庫查詢，發現miR-133b的靶基因可能為MMP-9。有學者報道MMP-9能夠特異性地降解MBP，以致廣泛的脫髓鞘和生長錐崩解進而導致神經傳導功能損害。本研究結果顯示，觀察組T1～T4與對照組MMP-9蛋白表達與miR-133b呈相反趨勢。這一結果在一定程度證明了MMP-9是miR-133b的靶基因，miR-133b可以造成MMP-9蛋白表達下調，而此時仍然需要細胞層次的功能驗證。本研究以DRG神經元為工具細胞，抑制或過表達miR-133b，觀察細胞軸突形態以及MMP-9蛋白表達改變，結果顯示在神經元水平miR-133b能夠通過其靶基因MMP-9調節神經細胞軸突生長狀態。

綜上所述，ATM患者患病后中樞神經系統miR-133b表達下調，致使其靶基因MMP-9上調產生臨床癥狀。miR-133b是ATM潛在的治療靶點。ATM后有681個miRNA至少在任一樣本發生變化，本研究中miR-133b可能只是ATM潛在的治療靶點之一，今后的實驗中我們將繼續探索其他可能發揮作用的關鍵miRNA及通路，為臨床治療ATM找到更多更有效的治療靶點和診斷標志物。