褪黑素調控SIRT1/FOXO1通路延緩椎間盤髓核細胞退變的實驗研究

左 斌，夏曉楓，車 彪，何精選，唐家國

腰椎間盤突出是由多種因素產生的復雜脊柱疾病[1]，主要原因為椎間盤退變。腰椎間盤組織再生能力有限，而髓核細胞(NPCs)是腰椎間盤組織的唯一構成細胞，NPCs退變可直接使椎間盤組織中細胞數量減少[2]。椎間盤退變的機制涉及NPCs凋亡和炎癥反應的產生，褪黑素不僅能促進NPCs的增殖[3]，還能抵抗氧化應激誘導的NPCs凋亡[4]。沉默信息調節因子(SIRT)可以降低氧化應激水平和炎癥程度[5]，還可通過叉頭框轉錄因子O1(FOXO1)途徑調節氧化應激誘導的大鼠NPCs衰退[6]。但是褪黑素調控SIRT1/FOXO1通路對椎間盤NPCs退變的影響，目前報道較少。本研究通過使用過氧化氫處理椎間盤NPCs以誘導氧化性損傷，模擬體外NPCs退變，并干擾SIRT1后使用褪黑素處理，旨在從SIRT1/FOXO1通路探討褪黑素對椎間盤NPCs退變的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1人椎間盤髓核組織：本研究所用髓核組織源于長江航運總醫院骨外科腰椎間盤突出癥患者12例，年齡45～67歲，平均52歲，保守治療無效。所有患者均已自愿簽訂知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會審批，倫理批準編號：L20200058。

1.1.2主要試劑和儀器：褪黑素(原料藥，純度99%，西安金綠生物工程技術有限公司,批號：73-35-2)；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)購自北京智杰方遠科技有限公司,批號：VN10053；siRNA NC(RNA干擾陰性對照)和siRNA SIRT1(RNA干擾SIRT1表達載體)均由上海生工生物科技有限公司合成(批號：K10059、K10061)；RNA抽提試劑盒(批號：P1063)、逆轉錄試劑盒(批號：PD5017)、熒光定量PCR試劑盒(批號：SF4113L)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號：C1065S)均購自上海碧云天生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號：m1034517)、白細胞介素-1β(IL-1β，批號：m1062451)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；聚集蛋白聚糖(Aggrecan，批號：ab60133)、Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，批號：ab60472)、SIRT1(批號：ab60355)、FOXO1乙酰化(acely-FOXO1，批號：ab60857)購自美國Abcam公司；FLUOstar Omega型全自動多功能酶標儀購自德國BMG LABTECH公司；TL988型qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；Attune NxT型流式細胞儀購自北京昊諾斯科技有限公司。

1.2方法

1.2.1NPCs的分離與培養：將12例髓核組織用無菌眼科剪剪成約1 mm3的塊狀后混合，加入適量0.25%胰蛋白酶消化30 min后。置于0.2% Ⅱ型膠原酶中室溫消化4 h。使用200目濾網過濾并離心收集細胞，然后加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞，放入37 ℃含5% CO2的培養箱中培養。當細胞貼壁生長后，使用倒置顯微鏡觀察并鑒定細胞。當細胞密度為80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代并進行后續實驗。

1.2.2CCK-8法檢測NPCs的細胞活性：收集NPCs，調整細胞濃度為每毫升1×105個，每孔接種100 μl至96孔板中，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h使細胞貼壁，空白孔加入100 μl培養液，其余各孔依次加入終濃度為0、100、200、300、400 μmol/L過氧化氫或終濃度為0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素的培養液，繼續培養24 h，加入濃度為10%的CCK-8溶液，培養2 h后，于酶標儀上檢測各孔在450 nm波長下的OD值。每組各設6個復孔。細胞增殖率(%)=(實驗孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)/(對照孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)×100%。

1.2.3細胞轉染與分組：調整NPCs濃度為每毫升1×106個，接種于6孔板，使用Lipfectamine 3000轉染試劑盒分別將siRNA NC和siRNA SIRT1轉染細胞24 h后，使用200 μmol/L過氧化氫處理以誘導氧化性損傷，細胞分為過氧化氫組(僅使用200 μmol/L過氧化氫處理)、褪黑素+過氧化氫組(200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)、褪黑素+siRNA NC組(細胞轉染siRNA NC后使用200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)、褪黑素+siRNA SIRT1組(細胞轉染siRNA SIRT1后使用200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)，另取不使用過氧化氫處理的非轉染NPCs作為對照組。各組細胞處理24 h后，檢測各項指標。

1.2.4SIRT1 mRNA表達水平檢測：RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，逆轉錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應體系：2×SYBR mix 10 μl，水8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應條件設定為：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、72 ℃延伸10 min，40個循環。以GAPDH為內參，根據2-ΔΔCt計算SIRT1 mRNA表達水平。SIRT1、GAPDH引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率：收集各組細胞，1200 r/min，離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后，加入400 μl結合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μl Annexin V染液，輕輕混勻后置于2～8 ℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μl PI輕輕混勻，于2～8 ℃避光下繼續孵育5 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復6次。

1.2.6ELISA檢測TNF-α、IL-1β含量：收集各組細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，每組設置6個重復。

1.2.7蛋白免疫印跡法檢測退化相關指標Aggrecan、collagen Ⅱ以及SIRT1、FOXO1蛋白表達水平：收集各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，應用BCA蛋白定量試劑盒進行定量檢測。然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、1∶1000濃度稀釋后的Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、FOXO1、acely-FOXO1和GAPDH一抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育2 h。用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像分析系統拍照。以GAPDH為內參，分析各組蛋白表達水平，每組設置6個重復。

2 結果

2.1原代退變椎間盤NPCs形態 人原代退變椎間盤NPCs多呈類圓形、多角形或梭形。見圖1。

圖1 人原代退變椎間盤NPCs形態(×40)NPCs為髓核細胞

2.2褪黑素對過氧化氫處理NPCs增殖率的影響 200、300、400 μmol/L過氧化氫均可顯著抑制NPCs增殖(P<0.05)。后續將使用200 μmol/L過氧化氫處理以誘導氧化性損傷。使用0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素處理損傷NPCs后發現，1 μmol/L褪黑素能顯著提高200 μmol/L過氧化氫處理的NPCs增殖率(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度褪黑素對過氧化氫處理的NPCs增殖率的影響NPCs為髓核細胞；與過氧化氫0 μmol/L時比較，aP<0.05；與過氧化氫濃度為200 μmol/L、褪黑素0 μmol/L時比較，bP<0.05

2.3褪黑素對過氧化氫處理NPCs中SIRT1 mRNA表達水平的影響 5組STRTI mRNA表達水平分別為：對照組1.00±0.00、過氧化氫組0.52±0.06、褪黑素組0.83±0.09、褪黑素+siRNA NC組0.87±0.10、褪黑素+siRNA SIRT1組0.46±0.05。與對照組比較，過氧化氫組NPCs中SIRT1 mRNA表達水平降低(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs中SIRT1 mRNA表達水平升高(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs中SIRT1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。

2.4褪黑素對過氧化氫處理NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量的影響 與對照組比較，過氧化氫組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組比較，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)。見表1。

表1 5組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量比較

2.5褪黑素對過氧化氫處理的NPCs細胞凋亡的影響 5組細胞凋亡率分別為：對照組(3.87±0.39)%、過氧化氫組(34.35±3.52)%、褪黑素組(12.26±1.35)%、褪黑素+siRNA NC組(13.55±1.48)%、褪黑素+siRNA SIRT1組(25.64±3.63)%。與對照組比較，過氧化氫組NPCs凋亡率升高(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs凋亡率降低(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組比較，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs凋亡率升高(P<0.05)。

2.6褪黑素對過氧化氫處理的NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1和FOXO1蛋白表達的影響 與對照組比較，過氧化氫組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。與過氧化氫組相比，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達水平升高，acely-FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)。與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 5組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、acely-FOXO1蛋白表達水平比較

3 討論

有研究報道，遺傳和環境因素均可引起椎間盤退變[7]，而NPCs是構成椎間盤組織的唯一細胞，其功能的衰退是引起椎間盤退變的主要原因[8]。另外，過氧化氫可在體外處理NPCs以誘導氧化性損傷模擬椎間盤功能衰退[9]。本研究結果顯示，過氧化氫能顯著抑制NPCs增殖，且1 μmol/L褪黑素能顯著提高NPCs增殖率。因此后續分別使用200 μmol/L過氧化氫和1 μmol/L褪黑素處理椎間盤NPCs。

椎間盤退變發病機制包括細胞氧化應激、線粒體功能障礙和細胞凋亡，褪黑素可以消除氧自由基，調節線粒體的平衡和功能，防止細胞凋亡[10]。Guo等[11]研究發現褪黑素能有效預防骨關節炎。另外，Zhang等[12]研究發現褪黑素可減輕大鼠椎間盤退變和炎癥。褪黑素治療可改善人軟骨細胞的增殖，促進軟骨細胞外基質蛋白(Aggrecan和collagen Ⅱ)的表達[13]。另外，在退變椎間盤中SIRT1表達降低，SIRT1的激活可以抑制NPCs的凋亡，促進細胞增殖[14]。在椎間盤退變過程中Aggrecan和collagen Ⅱ蛋白表達水平顯著降低，導致椎間盤形態及結構改變[15]。本研究結果顯示，褪黑素能顯著提高NPCs中SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達水平，并使TNF-α和IL-1β含量、細胞凋亡率及acely-FOXO1蛋白水平顯著降低。Ge等[16]研究發現，褪黑素能夠改善細胞存活和功能，從而保護椎間盤不發生退變。另外，褪黑素可抵抗脂多糖處理的大鼠海馬組織氧化應激損傷、急性神經炎癥和凋亡性神經退行性變[17]。以上研究表明，褪黑素可調節細胞外基質蛋白表達水平，降低炎癥反應和細胞凋亡，緩解椎間盤NPCs退變。本研究結果同時顯示，與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，干擾SIRT1顯著提高細胞凋亡率，與Shen等[18]研究結果一致。另外，干擾SIRT1還能顯著降低SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達水平，顯著提高TNF-α和IL-1β含量及acely-FOXO1蛋白水平，提示干擾SIRT1能夠逆轉褪黑素延緩椎間盤NPCs退變的作用。

綜上所述，褪黑素能夠通過上調SIRT1表達，抑制FOXO1乙酰化，減輕炎癥反應，減少細胞凋亡，緩解椎間盤NPCs退變，而干擾SIRT1能逆轉褪黑素的保護作用。但是褪黑素對椎間盤NPCs退變的作用機制較為復雜，尚需深入研究。