肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏防治凍傷作用的藥效學實驗研究

崔亞玲，劉小虎，許子華，吳 瓊

凍傷是由于低溫或在寒冷環境中長時間暴露而發生的全身或局限性組織損傷，常發生在環境溫度低于0 ℃時，多發生于肢端尤其是關節突出的部位[1-2]。凍傷患者缺血性組織損傷和壞死的發生率較高，隨著凍傷皮膚溫度的下降，內皮細胞損傷可導致四肢局部水腫；血液黏度增高會引起血液流速減慢，并形成微血栓。微血管損傷、靜脈淤滯和微血栓都會促進凍傷引起的局部缺血[3]。凍傷病程較長，反復發作，無特效治療方法。肌醇煙酸酯是一種溫和的周圍血管擴張劑，可選擇性地使寒冷刺激的病變部位和敏感部位的血管擴張，而對正常血管的擴張作用則較弱。肝素鈉屬黏多糖類物質，能干擾凝血過程的許多環節，其機制主要通過與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)結合，而增強對活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用，阻止血小板凝集和破壞，妨礙凝血激酶的形成；阻止凝血酶原變為凝血酶；抑制凝血酶，從而抑制纖維蛋白原變成纖維蛋白。肝素鈉常用于防治血栓形成或栓塞性疾病引起的彌漫性血管內凝血(DIC)，也用于血液透析、體外循環、導管術等操作中及血液標本抗凝處理。本研究分析了肝素鈉和肌醇煙酸酯以不同比例配伍聯合用藥對提高機體冷刺激耐受力的效果，旨在探討肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對大鼠輕度凍傷的防治作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗儀器：N4型紫外可見分光光度計(INESA)，PV-200型足趾容積測量儀(成都泰盟科技有限公司)。DT-100電光分析天平(北京光學儀器廠)。PBY-N6 Compact全自動血液流變儀(北京普利生食品有限公司)。CA1500全自動凝血分析儀、XN-1000全自動模塊式血液分析儀均購于SYSMEX公司。FLPI2-MOOR和MOORVMS-OXY均購于MOOR生產公司。BC/BC-518A臥式冷藏冷凍轉換柜(青島海爾特種電冰柜有限公司)。

1.1.2實驗藥物：肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏(中國人民解放軍北部戰區總醫院，批號：201508063)；肝素鈉乳膏(山東博士化福瑞達制藥有限公司，批號：150624031)；賦形劑——肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏基質(中國人民解放軍北部戰區總醫院提供，批號：201508062)；乙酸(沈陽化學試劑有限公司)；二甲苯(天津市百世化工有限公司)；伊文思藍(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3實驗動物：SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001。SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2方法

1.2.1飼養方法：各組雌雄小鼠、大鼠分籠飼養,常規顆粒飼料喂養，自由飲水，12 h自然光照，室溫控制在0～25 ℃, 濕度為40%～60%。無菌墊料、飲水瓶定時更換，定時消毒。

1.2.2肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響：將昆明種小鼠60只，隨機分為對照組、模型組和低、中、高劑量組(分別給予肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏0.39、0.78、1.56 g/kg)及肝素鈉乳膏組(0.39 g/kg)，每組10只。對照組、模型組右耳部正反面涂抹賦形劑；高劑量組右耳正反面涂抹肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，4/d；中劑量組右耳正反面涂抹肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，2/d；低劑量組右耳正反面涂抹肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，1/d；肝素鈉乳膏組右耳正反面涂抹肝素鈉乳膏，1/d。6組均涂藥7 d。第7天涂藥后1 h，用干棉簽將殘留藥膏擦干凈，除對照組外其余各組小鼠右耳郭滴加20 μl二甲苯，20 min后處死小鼠，剪下左右耳，用7 mm打孔器沿左右耳郭相同部位打孔取材，分別稱重，以兩耳重量差值作為腫脹程度[4]，并進行統計學分析。

1.2.3肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響：取體質量18～22 g小鼠60只，雌雄各半，隨機分成對照組和低、中、高劑量組(分別給予肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏0.39、0.78、1.56 g/kg)及肝素鈉乳膏組(0.39 g/kg)，每組10只。給藥組小鼠按規定劑量外用給藥，空白對照組給予賦形劑，劑量同低劑量組，連續給藥7 d，末次給藥后30 min，各組均于鼠尾靜脈注射1%伊文思藍生理鹽水0.1 ml/10 g后，每只大鼠立即腹腔注射0.6%乙酸0.2 ml，30 min后斷頸處死小鼠，用5 ml生理鹽水沖洗腹腔滲出的伊文思藍，吸取腹腔液，3000 r/min離心5 min，取上清液，用分光光度計在波長590 nm測定吸光度[5]。

1.2.4肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏預防給藥對大鼠實驗性凍傷模型的影響：取體質量為180～220 g健康SPF級大鼠60只，雌雄各半，隨機分為對照組、模型組和低、中、高劑量組(分別給予肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏0.27、0.54、1.08 g/kg)及肝素鈉乳膏組(0.27 g/kg)，每組10只。除對照組外，各組大鼠右后肢涂對應劑量的藥物，模型組涂賦形劑，連續給藥7 d；于第7天給藥1 h后將除對照組外的各組大鼠放入-20 ℃冰柜中，1 h后取出，造成Ⅰ度凍傷模型(Ⅰ度凍傷：傷及表皮，皮膚局部紅腫、充血，癥狀在暖和時緩慢消失，表皮脫落，水腫消退，不留瘢痕)，讓其在室溫下自然復溫。各組大鼠分別于凍傷造模前和凍傷造模后測量右后足趾容積，觀察造模前后大鼠足跖容積變化值，計算足跖腫脹值(造模后容積與造模前容積之差)[6-7]，于造模第7天測定大鼠右后足局部血流量和血氧，并進行統計學分析。

1.2.5肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對大鼠實驗性凍傷模型的影響:大鼠分組、用藥及造模方法同“1.2.4”；各組大鼠于造模后第2天右后肢涂對應劑量的藥物，模型組涂賦形劑，連續給藥7 d。分別于凍傷造模前和凍傷造模后1、3、5、7 d測量各組大鼠右后足趾容積變化值，計算足跖腫脹值(造模后容積與造模前容積之差)，于造模第7天測定大鼠右后足局部血流量和血氧，并進行統計學分析。

2 結果

2.1肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 6組小鼠耳腫脹度為對照組(0.010±0.001)g、模型組(0.016±0.005)g、低劑量組(0.010±0.002)g、中劑量組(0.010±0.003)g、高劑量組(0.010±0.003)g、肝素鈉乳膏組(0.010±0.011)g。與對照組比較，模型組二甲苯所致小鼠耳腫脹度明顯提高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏低、中、高劑量組及肝素鈉乳膏組小鼠耳腫脹減輕(P<0.05)。

2.2肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 對照組和低、中、高劑量組及肝素鈉乳膏組小鼠腹腔液吸光度分別為1.01±0.35、0.67±0.29、0.63±0.29、0.63±0.17、0.63±0.17。與對照組比較，低、中、高劑量組和肝素鈉乳膏組小鼠腹腔液吸光度均降低(P<0.05，P<0.01)。

2.3肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏預防給藥對大鼠實驗性凍傷模型的影響 模型組凍傷后足趾腫脹值高于對照組(P<0.01)，說明造模成功。與對照組比較，模型組血流量增高，血氧降低(P<0.01)。與模型組比較，造模7 d后，低、中、高劑量組和肝素鈉乳膏組大鼠足跖腫脹值和血流量降低(P<0.01)，但血氧比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏預防給藥對大鼠凍傷模型足跖腫脹值、血流量及血氧的影響

2.4肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對大鼠實驗性凍傷模型的影響 與對照組比較，模型組凍傷造模后第5、7天腫脹值增高更顯著(P<0.05，P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，低、中、高劑量組和肝素鈉乳膏組造模后第5、7天大鼠足跖腫脹值降低(P<0.01)。與對照組比較，模型組凍傷后第7天血流量增高，血氧含量降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，連續給藥7 d后，低、中、高劑量組及肝素鈉乳膏組血流量降低，低、中劑量組血氧升高(P<0.01)。見表2。

表2 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對大鼠凍傷模型足跖腫脹、血流量及血氧的影響

3 討論

凍傷是高寒地區或從事低溫作業人員的常見急癥，Ⅱ度凍傷傷及真皮，皮膚局部明顯充血、水腫，12～24 h內形成水皰，2～3周內干燥結痂，以后脫痂愈合，可有輕度瘢痕形成。Ⅲ～Ⅳ度為重度凍傷，主要損傷全層皮膚、皮下組織、肌肉和骨骼[8-9]。

凍傷是機體的一部分組織因寒冷侵襲而出現的血液循環障礙，主要表現為凍結的表面組織融化后產生炎癥反應[10-12]。有研究表明，凍傷可引起微血管收縮、毛細血管通透性提高、血液黏度增加、血流阻力增大等，使局部組織血流量明顯減少，最終導致組織細胞因缺血缺氧而壞死[13-14]。本研究結果顯示，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏具有明顯改善二甲苯造成耳部急性滲出性炎性水腫和抑制醋酸引起腹腔毛細血管通透性增強的作用，說明肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏能夠消除炎癥反應，防止皮膚感染，并能有效透過凍傷的皮損，降低毛細血管通透性；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏預防及治療給藥能明顯減輕輕度凍傷模型大鼠足跖腫脹度和充血，治療7 d后大鼠凍傷后足跖腫脹及血流量基本恢復至正常水平。前期實驗研究結果顯示，大鼠冷凍恢復室溫后，血流量明顯降低，第3天開始皮膚溫度和血流量持續升高，炎癥反應加重，給藥治療3～7 d后，血流量和足腫脹基本恢復正常，能夠很好地防治輕度凍傷。

綜上所述，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對大鼠凍傷后的組織有明顯的保護作用，具有良好的抗炎、預防和治療輕度凍傷的作用。