靶向調(diào)節(jié)GSK-3β基因?qū)毙砸谎趸贾卸敬笫竽X損傷的保護(hù)作用研究

吳啟仙,寧紅平,吳興輝,李厚成

目前，CO中毒發(fā)病率和病死率較高[1]。大氣中CO的正常濃度<0.001%，當(dāng)CO濃度為0.1%時(shí)可能致命。急性CO中毒會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[2]。許多研究表明，免疫和炎癥反應(yīng)在CO中毒后的腦損傷中起重要作用。糖原合成激酶-3β(GSK-3β)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變中起關(guān)鍵作用。有人提出將GSK-3β失活作為促進(jìn)神經(jīng)元存活的機(jī)制[3]。藥理學(xué)抑制劑或RNA干擾誘導(dǎo)的GSK-3β耗竭足以阻止谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性和所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。TDZD-8是一種GSK-3β抑制劑，縮小了腦缺血損傷后的梗死體積。最近研究表明，在自身免疫性疾病、帕金森病、出血性腦損傷等疾病中GSK-3β表達(dá)上調(diào)[4]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是參與誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。CO中毒所致的腦損傷與腦部的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5]：GSK-3β易位進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-6。因此，減輕炎癥反應(yīng)是急性CO中毒的主要治療方法之一。本研究探討靶向調(diào)節(jié)GSK-3β基因?qū)毙訡O中毒大鼠腦損傷的保護(hù)作用，為急性CO中毒腦損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，18周齡，體質(zhì)量310～360 g，由中國北京生命河實(shí)驗(yàn)室提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0006，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2020-0012。大鼠圈養(yǎng)在12 h明/暗循環(huán)中，溫度18～22 ℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食嚙齒類動(dòng)物飼料和水。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組，每組20只。

1.2主要藥品、試劑與儀器 GSK-3β基因過表達(dá)的慢病毒(LV-GSK-3β，批號(hào)：qw-2098239.13)、空白慢病毒(LV，批號(hào)：982737818.3)均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；ProOx-820動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙(天津合普)、DS-09水迷宮實(shí)驗(yàn)臺(tái)(上海移數(shù)信息科技有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(中國碧云天生物科技，批號(hào)：CV-59653.36)、TUNEL法(美國OriGene Technologies生物科技，批號(hào)：CB-54893.63)、BX50光學(xué)顯微鏡(日本Olympus Corporation)、Trizol試劑(美國Invitrogen，批號(hào)：ED-85463.36)、PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司，批號(hào)：CE-4586.36)、ABI 7900系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)、SYBR Green Master PCR試劑盒(中國碧云天生物科技，批號(hào)：SD-45896.36)、總蛋白提取試劑盒(北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)BC3640-50T)；二辛可寧酸測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific，批號(hào)：2322.635)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Bio-Rad Laboratories,批號(hào)：DE-4789.36)、PVDF膜(美國EMD Millipore，批號(hào)：RT-7485.63)、BSA(美國Sigma-Aldrich，批號(hào)：RT-741.369)；抗GSK-3β一抗(1∶1000，美國Abcam，目錄號(hào)ab37150)、抗STAT3一抗(1∶1000，美國Abcam，目錄號(hào)ab38898)、抗β-actin一抗(1∶1000，美國Abcam，目錄號(hào)ab8227)、辣根過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000，美國Abcam，批號(hào)：ab6721)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(德國Hanbio Biotechnology Co，批號(hào)：CD-48586.36)。

1.3模型制備 CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組大鼠于ProOx-820動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙吸入CO氣體，先暴露于1000 mg/L的CO氣體40 min，然后再暴露于3000 mg/L的CO氣體20 min；當(dāng)大鼠碳氧血紅蛋白(HbCO)濃度>40%，且意識(shí)不清說明CO中毒模型制備成功。建模成功后，慢病毒空白組通過10 μl Hamilton注射器將0.25 μl 的 LV-EGFP 稀釋液(4×106TU病毒顆粒)注射到大鼠雙側(cè)海馬體中；GSK-3β低表達(dá)組通過10 μl Hamilton注射器將0.25 μl的LV-GSK-3β稀釋液(4×106TU病毒顆粒)注射到大鼠雙側(cè)海馬體中，1/d，共4 d。CO中毒模型組以同樣的方法注射生理鹽水。正常對(duì)照組無任何處理。

1.4大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 CO處理后第6天進(jìn)行改進(jìn)的莫里斯水迷宮測試程序。隨機(jī)選擇各組中的6只大鼠進(jìn)行莫里斯水迷宮測試。使用直徑為150 cm的水箱，水溫保持在(24±1)℃。水上涂有黑色蛋彩畫顏料，以遮蓋平臺(tái)并增加顏色對(duì)比度。在象限1的水面下方1 cm處隱藏著一個(gè)10 cm×10 cm的黑色平臺(tái)，將大鼠置于水中的進(jìn)入點(diǎn)，隨機(jī)改變?yōu)槊嫦蛳笙?、3或4的象限，每次實(shí)驗(yàn)持續(xù)到大鼠找到固定平臺(tái)為止，若未找到平臺(tái)最多持續(xù)60 s，同時(shí)將平臺(tái)撤除，開始60 s的探查訓(xùn)練。將大鼠由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限(原先放置平臺(tái)的象限)所花時(shí)間(原平臺(tái)象限停留時(shí)間)和進(jìn)入該象限的次數(shù)(經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù))。將所有大鼠在平臺(tái)上擱置10 s進(jìn)行學(xué)習(xí)，并且每天連續(xù)進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，連續(xù)3 d。經(jīng)過3 d培訓(xùn)后，進(jìn)行了最終測試。使用莫里斯水迷宮軟件系統(tǒng)記錄大鼠在每個(gè)象限中花費(fèi)的時(shí)間。對(duì)于每只大鼠，定位平臺(tái)平均潛伏時(shí)間被視為學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。

1.5大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 將腦組織在室溫下于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，在分級(jí)乙醇系列中脫水，然后將其冠狀切成4 μm切片。使用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫石蠟處理，并按降序乙醇系列重新水化。用TUNEL法定量檢測神經(jīng)元凋亡情況。正常細(xì)胞核染成藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核染成棕黃色。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察神經(jīng)元凋亡情況。

1.6大鼠海馬組織病理結(jié)構(gòu)觀察 海馬組織在4%甲醛中固定過夜，石蠟包埋，然后切成4 μm厚的連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色以觀察CO暴露后海馬組織的病理結(jié)構(gòu)變化。

1.7大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3 mRNA表達(dá)水平測定 根據(jù)制造商規(guī)程，使用Trizol試劑從腦組織中分離總RNA。使用PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將GSK-3β、STAT3逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后在ABI 7900系統(tǒng)上使用SYBR Green Master PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR；GSK-3β、STAT3引物由上海生工科技生物合成。PCR熱循環(huán)條件：在95 ℃初始變性3 min； 40個(gè)循環(huán)(95 ℃持續(xù)20 s和60 ℃持續(xù)1 min)。GSK-3β、STAT3表達(dá)水平使用2-ΔΔCq方法進(jìn)行定量檢測，并標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)部參考基因U6基因。

1.8大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3蛋白表達(dá)水平測定 根據(jù)制造商的規(guī)程，使用總蛋白提取試劑盒從腦組織中提取總蛋白。使用二辛可寧酸測定試劑盒定量總蛋白，使用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。電泳后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；轉(zhuǎn)移后，將其在含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中封閉2 h。將膜與抗GSK-3β、STAT3、GAPDH的一抗在4 ℃孵育過夜。然后用Tween-20(TBST)的TBS清洗膜3次，并與辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗孵育。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測。使用ImageQuant軟件對(duì)蛋白印跡進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1大鼠逃避潛伏期、經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)、原平臺(tái)象限停留時(shí)間比較 與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組逃避潛伏期延長，經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)減少，原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短(P<0.05)。與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組逃避潛伏期縮短，經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)增多、原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠逃避潛伏期、經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)、原平臺(tái)象限停留時(shí)間比較

2.2大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平比較 4組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平分別為正常對(duì)照組(74.59±4.09)個(gè)/mm2、CO中毒模型組(827.87±5.76)個(gè)/mm2、慢病毒空白組(878.74±4.65)個(gè)/mm2、GSK-3β低表達(dá)組(453.87±4.75)個(gè)/mm2。與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平升高(P<0.05)；與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 4組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL×400)CO為一氧化碳,GSK-3β為糖原合成激酶-3β

2.3大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)病理改變 正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；CO中毒模型組、慢病毒空白組海馬神經(jīng)元排列紊亂，壞死明顯，可見炎性細(xì)胞浸潤，伴白色纖維組織增生；GSK-3β低表達(dá)組海馬神經(jīng)元壞死數(shù)目減少，炎性細(xì)胞浸潤減少，白色纖維組織增生面積縮小。見圖2。

圖2 4組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)病理改變情況(HE×400)CO為一氧化碳,GSK-3β為糖原合成激酶-3β

2.4大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組海馬組織GSK-3β、STAT3 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組海馬組織GSK-3β、STAT3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠海馬組織 GSK-3β、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較

2.5大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組腦組織GSK-3β、STAT3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組腦組織GSK-3β、STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 4組大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3蛋白免疫印跡圖A.正常對(duì)照組；B.CO中毒模型組；C.慢病毒空白組；D.GSK-3β低表達(dá)組;CO為一氧化碳,GSK-3β為糖原合成激酶-3β，STAT3為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3

表3 4組大鼠海馬組織GSK-3β、STAT3蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

CO中毒的某些病理生理學(xué)效應(yīng)與缺血再灌注損傷相一致，因?yàn)樵趦煞N情況下，均存在一個(gè)缺氧階段，隨后通常會(huì)進(jìn)行復(fù)氧。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路是腦缺血后主要的凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且該信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞存活很重要。在生理?xiàng)l件下，Akt以低活性形式位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號(hào)刺激(局部缺血或缺氧)時(shí)，Akt的C端Ser 473殘基會(huì)被磷酸化激活，從而調(diào)節(jié)上游分子。活化的Akt通過多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞存活，主要機(jī)制為抑制GSK-3β活性以防止其發(fā)揮凋亡作用[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈閉塞后大鼠模型神經(jīng)元中GSK-3β的表達(dá)在缺血和再灌注后的1～3 h有所增加，峰值出現(xiàn)在1 h，這表明GSK-3β信號(hào)通路參與早期缺血-再灌注中腦缺血誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)[7]。在短暫性全腦缺血和局灶性腦缺血模型中，GSK-3β的水平升高，這可能有助于保護(hù)神經(jīng)元免受致命性缺血性損傷，應(yīng)用GSK-3β抑制劑后缺血性損傷減輕[8-9]。在90 min的局灶性腦缺血模型(嚴(yán)重缺血)中，GSK-3β被激活以促進(jìn)細(xì)胞凋亡；相反，在5 min整體缺血模型(輕度腦缺血模型)中，GSK-3β失活以促進(jìn)細(xì)胞存活。文獻(xiàn)報(bào)道，新生鼠缺氧性腦損傷的前24 h最關(guān)鍵，其中神經(jīng)元凋亡的高峰時(shí)間和加重繼發(fā)性腦損傷的最嚴(yán)重階段發(fā)生在缺氧性腦損傷24 h[10-11]。在本研究中，CO暴露時(shí)間為60 min，類似于局灶性嚴(yán)重腦缺血模型，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組逃避潛伏期明顯延長，經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)減少、原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短。與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組逃避潛伏期明顯縮短，經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)增多、原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長。提示靶向抑制GSK-3β基因表達(dá)對(duì)急性CO中毒大鼠腦損傷神經(jīng)功能具有保護(hù)作用。

文獻(xiàn)報(bào)道， GSK-3β抑制劑的治療作用與炎癥抑制有關(guān)；GSK-3β失活通過調(diào)節(jié)核因子-κB(NF-κB)和MLK3/JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生；抑制GSK-3β可誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌[12]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯升高；與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯降低。正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；CO中毒模型組、慢病毒空白組海馬神經(jīng)元排列紊亂，壞死明顯，可見炎性細(xì)胞浸潤，伴白色纖維組織增生；GSK-3β低表達(dá)組海馬神經(jīng)元壞死數(shù)目減少，炎性細(xì)胞浸潤減少，白色纖維組織增生面積縮小。提示靶向抑制GSK-3β通過抑制CO中毒腦組織損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡來減輕神經(jīng)炎癥損傷。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦室內(nèi)注入SB216763(GSK-3β抑制劑)可顯著減輕損傷引起的炎癥反應(yīng)；同時(shí)，SB216763處理后還檢測到更低水平的細(xì)胞凋亡。

STAT家族成員在先天免疫和炎癥反應(yīng)中很重要。有研究顯示STAT3及其家族成員在引發(fā)腦損傷的炎癥反應(yīng)中起主要作用。同時(shí)STAT3也是GSK-3β的靶向下游分子，STAT3的活化促進(jìn)了GSK-3β通路的激活，隨后導(dǎo)致促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)[13]。研究表明，免疫和炎癥反應(yīng)在腦缺血性損傷中起關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，STAT3信號(hào)通路通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加劇了腦損傷[14]。此外，在短暫性腦缺血的小鼠模型中和在體外低氧治療的小膠質(zhì)細(xì)胞中，STAT3的表達(dá)水平均上調(diào)。有研究報(bào)道，STAT3介導(dǎo)的NF-κB途徑可激活炎性因子的產(chǎn)生，包括TNF-α、IL-1β和IL-6[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CO中毒模型組、慢病毒空白組、GSK-3β低表達(dá)組腦組織GSK-3β、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高；與CO中毒模型組、慢病毒空白組比較，GSK-3β低表達(dá)組腦組織GSK-3β、STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示CO中毒后靶向抑制GSK-3β可抑制STAT3的表達(dá)進(jìn)而抑制促炎性介質(zhì)的釋放。因此，干擾GSK-3β、STAT3表達(dá)可能是CO中毒炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的治療目標(biāo)。

綜上所述，靶向抑制GSK-3β基因表達(dá)對(duì)急性CO中毒大鼠腦損傷神經(jīng)功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與靶向抑制GSK-3β可下調(diào)STAT3的表達(dá)進(jìn)而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。