空氣污染暴露對大鼠呼吸系統炎癥反應的影響及機制研究

朱敏立，胡 美，司少艷，李月越，王瑞娟，吳 瑋

隨著燃料的應用及工業化程度的提高，空氣污染是人類必須面對的問題，有研究報道其是造成過早死亡的主要環境因素[1]。研究顯示，空氣質量指數與兒童鼻炎和咳嗽發生頻率增加相關[2]?？諝馕廴疚锍煞质謴碗s，主要有一氧化碳(CO)、氮氧化物(NOx)、臭氧(O3)、碳氫化合物、硫氧化物及顆粒物(particulate matter， PM)等。氣體污染物和顆粒污染物均可導致機體損傷，但損傷機制尚不明確。本研究中通過將大鼠在實時大氣環境、過濾掉空氣動力學直徑>0.3 μm的細顆粒物的氣體環境和潔凈級環境中飼養3個月，觀察大鼠肺組織病理學變化、支氣管肺泡灌洗液中T淋巴細胞亞群及部分炎性因子的變化，探討空氣污染在呼吸系統反應中可能發揮的作用及炎癥機制。

1 材料及方法

1.1試劑和主要儀器 PerCP標記抗大鼠CD3抗體、FITC標記抗大鼠CD4抗體、PE標記抗大鼠CD8抗體均為eBioscience公司產品；炎性因子多因子檢測試劑盒及MAGPIX多功能液相芯片分析儀均為美國Millipore公司產品；FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品；空氣污染物動式暴露艙為濟南巨康凈化設備有限公司產品，由中國科學院大學生命科學學院提供。

1.2空氣質量數據采集 選取2016年12月1日—2017年2月28日空氣質量數據，來自國家氣象局北京市奧體中心(距離試驗中空氣采集點2 km處)氣象數據監測點官方數據。

1.3動物分組及空氣污染暴露方法 SPF級雄性SD大鼠27只，體質量180～200 g，隨機分為潔凈組、大氣組、過濾組，每組9只。將潔凈組大鼠放置于SPF動物房內飼養；大氣組大鼠放置于空氣污染物動式暴露艙，該飼養艙通過管路實時收集外界環境中大氣，艙內空氣質量等同于外界大氣環境；過濾組大鼠放置于空氣入口處放置HEPA濾膜的空氣污染物動式暴露艙，過濾掉空氣動力學直徑>0.3 μm的細顆粒物，其他等同于大氣組飼養艙。3組大鼠均給予普通飼料喂養，晝夜節律變化為12 h。

1.4標本采集 于2017年3月1日結束空氣污染暴露。各組大鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉后，用自制灌洗針將4 ℃生理鹽水經右側主支氣管注入右肺組織，行支氣管肺泡灌洗，每次灌洗量為3 ml，并反復抽吸，共灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將BALF收集在無菌離心管中并置于冰上，4 ℃ 1500 r/min離心5 min，收集細胞沉淀用于T淋巴細胞亞群檢測；BALF上清凍存于-80 ℃低溫冰箱，用于炎性因子分析。

1.5觀察指標

1.5.1肺組織病理學觀察：取左側肺臟下葉組織以10%多聚甲醛溶液固定，進行肺組織病理學觀察。制備肺組織石蠟切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色后，通過光學顯微鏡觀察肺組織病理學變化。

1.5.2BALF中炎性因子檢測和T淋巴細胞亞群分析：①采用液態懸浮芯片法檢測BALF中炎性因子，包括白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-13、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，嚴格按說明書進行操作。②BALF離心，細胞沉淀用100 μl含5%胎牛血清的1640懸浮，采用熒光素標記的抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+抗體對細胞進行標記，采用流式細胞儀進行分析，以CD3+ T細胞設門，檢測CD4+、CD8+ T細胞的百分比，然后計算CD4+/CD8+比值。

2 結果

2.1空氣質量數據 所有大鼠飼養時間為88 d，其中空氣質量優良23 d，嚴重及重度污染41 d，輕中度污染24 d?？諝赓|量指數(AQI)及PM2.5、PM10、CO、NO2、O3、SO2的含量為間隔1 h的動態數據，對數據進行正態性檢驗顯示，各指標均不符合正態分布，以中位數、四分位數、最小值和最大值表示。見表1。

表1 實驗期間采集大氣實時空氣質量數據

2.2大鼠體質量比較 3組大鼠均無意外死亡，體質量分別為潔凈組(509.93±22.49)g、大氣組(528.50±27.47)g、過濾組(533.67±13.25)g。3組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3大鼠肺組織病理比較 潔凈組大鼠肺組織肺泡完整，無明顯肺泡融合，肺間隔無明顯增寬，未見炎性細胞浸潤；過濾組大鼠部分肺組織出現肺間隔增寬，炎性細胞浸潤，部分肺泡融合、形成肺大泡；大氣組大鼠部分肺組織出現肺間隔增寬，炎性細胞浸潤，部分肺泡融合、形成肺大泡，程度較過濾組加重。見圖1。

圖1 不同暴露條件下3組大鼠肺組織病理變化(HE×200)

2.4大鼠BALF中T淋巴細胞水平比較 3組BALF中CD4+細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。與潔凈組比較，過濾組和大氣組BALF中CD8+水平升高，CD4+/CD8+水平降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，但大氣組和過濾組上述指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同暴露條件下3組大鼠BALF中淋巴細胞分類比較

2.5大鼠BALF中炎性因子含量比較 過濾組和大氣組BALF中IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α含量均顯著高于潔凈組(P<0.01)，但過濾組和大氣組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同暴露條件下3組大鼠BALF中炎性因子水平比較

3 討論

空氣污染與人類多種疾病的發生發展有關，可能有多種機制參與，包括氧化應激、炎性損傷及免疫損傷等，但具體機制尚不清楚。近年，關于細顆粒物對機體的有害影響研究很多。顆粒污染物由多種成分和灰塵構成，表面可附著多種毒性成分，PM2.5可經呼吸系統進入血液，被認為是對健康危害最大的空氣污染物之一。既往文獻報道，空氣中PM2.5濃度增加與肺功能指標短時間異常相關，并且與肺炎及慢性氣道疾病的發病率、住院率增高相關[3-4]。

文獻報道，大鼠暴露于高濃度PM2.5環境中后，BALF中炎性細胞增多，IL-6、IL-10等炎性因子水平升高，TNF-α水平下降；靜脈血中CD3+細胞增加，CD4+/CD8+比值降低[5-7]。有體外試驗證實，PM2.5可導致急性髓細胞系細胞TNF-α等炎性因子分泌增加[5]。本研究結果顯示，與潔凈組比較，過濾組和大氣組大鼠肺組織出現輕度炎性改變，可見部分肺泡融合形成肺大泡，且IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α水平升高；過濾組和大氣組BALF中CD8+升高，CD4+/CD8+比值下降。與上述研究結果類似。

本研究結果顯示，過濾組與大氣組IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+水平比較差異無統計學意義。分析其原因可能與本研究采用的污染環境暴露條件有關。在此次實驗期間，大鼠飼養88 d，其中重度以上空氣污染時間41 d，即相對于潔凈組和過濾組，大氣組大鼠接觸高濃度PM2.5環境時間占總觀察時間的46.6%。與部分研究采用高濃度PM2.5環境暴露相比，本研究PM2.5為實時空氣中的細顆粒物濃度，低于其他采集PM2.5制成混懸液復制霧霾動物模型的毒性。同時過濾艙的過濾膜對于直徑<0.3 μm的物質并不能起到過濾作用。近年來，空氣動力學直徑<0.1 μm的超細顆粒物(UFPs) 對機體的有害影響也逐漸受到重視。文獻報道，與同一地點同時采集的PM10和PM2.5相比，大氣環境中UFPs多環芳烴含量高，更容易導致細胞損傷[8]。UFPs不止與呼吸系統疾病相關，而且與心血管疾病密切相關[9-10]。由于UFPs顆粒細小、濃度易變、檢測難度大，故UFPs尚未納入日常監測。

張秀川等[10]對2014年北京地區大顆粒物進行分析，結果顯示附著在顆粒物表面的有害化學物質苯并芘等多環芳烴與AQI呈正相關。這些物質通過附著在顆粒物或游離狀態進入呼吸系統，繼而進入循環系統，對系統造成損傷[11]。研究顯示高濃度NO2可導致大鼠終末細支氣管上皮損傷和氣道纖毛破壞[12]。O3濃度增加等空氣污染可導致哮喘、急性呼吸道感染、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等急診就診次數增加，因哮喘急性發作住院率也明顯升高[13]。

綜上所述，空氣污染暴露可導致大鼠肺組織炎癥反應，使炎性因子和淋巴細胞分類不同程度改變，可能與IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α升高和T淋巴細胞構成改變有關。同時，導致空氣質量差的不同直徑顆粒物，以及不同成分的作用機制，需要進一步研究探討。