急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿miR-23a-3p、miR-30d與心功能和心肌損傷的關(guān)系

吳莎莎 楊帥 沈超 王宗強(qiáng) 吳紅棟

急性ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，SETMI)是心肌梗死的主要類型，患者因冠狀動脈斑塊破潰、夾層或裂隙引起冠狀動脈血流中斷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧，進(jìn)而出現(xiàn)壞死，心電圖表現(xiàn)為ST段抬高，是一種嚴(yán)重的心血管疾病[1]。SETMI患者就診時多以胸痛為主要臨床表現(xiàn)，但患者冠狀動脈因血栓導(dǎo)致閉塞，病變急驟，需要與心絞痛鑒別診斷，并給予及時有效的救治。微小RNA(microRNA，miR)是一種內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，它可以與靶基因分子3’非編碼序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)功能[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種miR參與了STEMI的發(fā)生和發(fā)展[3]。miR-23a-3p與心肌病變和心力衰竭的發(fā)生有密切關(guān)系，而miR-30d與血管損傷和心肌纖維化有密切關(guān)系，兩者可能對STEMI的預(yù)測及心功能、心肌損傷判斷具有一定價值[4,5]。本研究探討STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d與心功能和心肌損傷的關(guān)系，分析其預(yù)測價值，旨在為SETMI的診斷及嚴(yán)重程度判斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年10月至2020年4月我院收治的STEMI患者62例為STEMI組，同期醫(yī)院收治的穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)74例為SAP組。另選擇同期醫(yī)院體檢的健康人60例為健康對照組。STEMI組：62例患者中，男38例，女24例；年齡39～78歲，平均年齡(59.35±8.21)歲；紐約心臟病協(xié)會分級(New York Heart Association classification，NYHA)：Ⅰ級17例，Ⅱ級19例，Ⅲ級14例，Ⅳ級12例；吸煙史：有24例，無38例；飲酒史：有22例，無40例，家族遺傳史：有34例，無28例；糖尿病18例、高血壓33例、高脂血癥45例。SAP組：74例患者中，男34例，女40例；年齡38～78歲，平均年齡(58.05±9.12)歲；NYHA：Ⅰ級39例，Ⅱ級26例，Ⅲ級9例；吸煙史：有30例，無44例；飲酒史：有29例，無45例，家族遺傳史：有41例，無33例；糖尿病21例、高血壓36例、高脂血癥49例。健康對照組：60例健康人中，男36例，女24例；年齡38～76歲，平均年齡(59.35±9.34)歲。3組性別比、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①STEMI患者符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，SAP患者符合《ACC/AHA慢性穩(wěn)定型心絞痛診療指南修訂綱要》中的標(biāo)準(zhǔn)[7]；②患者初次發(fā)病，年齡≥18歲；③患者及家屬對研究知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤、急慢性感染、急性腦梗死、腦出血者；②合并嚴(yán)重肝、腎功能障礙者；③既往進(jìn)行PCI治療者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集:STEMI及穩(wěn)定型心絞痛患者于入院次日采集空腹肘靜脈血6 ml，分裝3個試管，2 ml/個，健康對照組于體檢當(dāng)日采集空腹肘靜脈血6 ml，分3個試管，每個2 ml，置入EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，分離血漿，-50℃冰箱中保存。

1.3.2 血漿miR-23a-3p、miR-30d檢測:取1個試管血漿加入Trizol試劑，試劑盒購自美國Invitrogen公司，通過Trizol法提取血漿總RNA，應(yīng)用BioPhtometer Plus分光光度計(jì)測量總RNA濃度。制備cDNA，反應(yīng)體系為：血漿RNA 2 μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.3 μl，核糖核酸酶抑制劑 0.4 μl，引物0.8 μl， 脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)0.4 μl，緩沖液 4 μl，加入焦碳酸二乙酯水至反應(yīng)體系20 μl，混勻后37℃水浴1 h。然后進(jìn)行實(shí)時定量熒光PCR(Real time quantitative fluorescent PCR，qRT-PCR)反應(yīng)，內(nèi)參為U6。反應(yīng)體系為：cDNA 5 μl， Taq DNA聚合酶0.4 μl，上下游引物1 μl，PCR反應(yīng)液至25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共計(jì)40個循環(huán)，采用3個復(fù)孔，重復(fù)3次，采用GenEx 軟件分析與 2-ΔΔCT法計(jì)算miR-23a-3p、miR-30d相對表達(dá)量。

1.3.3 心肌損傷標(biāo)志物及氨基末端腦鈉肽前體(amino terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)檢測:取剩余試管血漿，其中1個試管血樣應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測血漿乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌鈣蛋白I(Troponin I，cTnI)水平，操作在Beckman DX1800全自動免疫分析儀上完成，剩余1個試管血樣應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿NT-proBNP水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.3.4 左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)檢測:采用彩色超聲多普勒診斷儀(飛利浦IE33)測量3組LVEF。

2 結(jié)果

2.1 3組血漿miR-23a-3p、miR-30d水平比較 STEMI組血漿miR-23a-3水平顯著低于SAP組、健康對照組，miR-30d水平顯著高于SAP組和健康對照組，SAP組血漿miR-23a-3p水平顯著低于健康對照組和miR-30d水平顯著高于健康對照組，3組miR-23a-3p、miR-30d水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組miR-23a-3p、miR-30d水平比較

2.2 3組心肌損傷標(biāo)志物、LVEF及NT-proBNP水平比較 STEMI組血漿LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平顯著高于SAP組和健康對照組，LVEF顯著低于于SAP組和健康對照組(P<0.05)，SAP組NT-proBNP水平高于健康對照組(P<0.05)，SAP組與健康對照組血漿LDH、CK、CK-MB、cTnI、LVEF水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組心肌損傷標(biāo)志物、LVEF及NT-proBNP水平比較

2.3 不同心功能STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d水平比較 隨NYHA心功能分級的升高，STEMI患者血漿miR-23a-3p水平逐漸降低，miR-30d、水平逐漸升高，3組間差異比較和趨勢分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同心功能STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d水平比較

2.4 STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d水平與心功能及心肌損傷指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示STEMI患者血漿miR-23a-3p水平與LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)，miR-30d與水平與LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP呈正相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

2.5 血漿miR-23a-3p、miR-30d對STEMI的預(yù)測價值

表4 STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d水平與心功能及心肌損傷指標(biāo)的相關(guān)性

2.5.1 兩指標(biāo)的單獨(dú)應(yīng)用： 以STEMI患者為陽性樣本，穩(wěn)定性心絞痛患者為陰性樣本，建立ROC(receiver operation characteristic，接收者工作特征曲線)診斷分析模型， 并參考臨床實(shí)踐將兩指標(biāo)劃分成7～10個組段。經(jīng)ROC分析知：兩指標(biāo)具有較高的診斷價值，ROC-AUC分別為0.771(0.693～0.858)、0.754(0.614～0.926)。

2.5.2 兩指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用： 采用SPSS軟件的聯(lián)合應(yīng)用ROC理論模式(LogP模式：對各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行Logistic綜合回歸，再依據(jù)所得OR，歸一化加權(quán)計(jì)算并對應(yīng)處理各樣本資料，并據(jù)其進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC分析)。結(jié)果：聯(lián)合應(yīng)用對STEMI的預(yù)測價值：AUC為0.843(0.739～0.962)。顯然其診斷效能均比單一指標(biāo)均有明顯提高。見表5，圖1。

表5 血漿miR-23a-3p、miR-30d對STEMI的預(yù)測價值之ROC分析結(jié)果

圖1 血漿miR-23a-3p、miR-30d對STEMI的預(yù)測價值的ROC曲線

3 討論

STEMI是一種重要的心肌梗死類型，占心肌梗死的60%～75%[8]。STEMI發(fā)病基礎(chǔ)是不穩(wěn)定粥樣斑塊，由于粥樣斑塊破潰、夾層或裂隙等導(dǎo)致冠狀動脈急性血栓形成，心肌血供驟然停止，發(fā)生缺血缺氧損傷[9]。目前臨床主張對于STEMI患者在發(fā)病早期即進(jìn)行介入治療，迅速疏通阻塞的冠狀動脈，以實(shí)現(xiàn)血流再通。然而對STEMI的早期診斷一直是臨床的難點(diǎn)之一。

近年來，隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，眾多分子生物學(xué)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。miRNA因參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，成為多種疾病的重要分子生物學(xué)標(biāo)志物[10]。研究表明，miR可以與靶基因mRNA的3’非編碼序列互補(bǔ)結(jié)合，從而調(diào)控mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[11]。

目前已有研究顯示，miR-23、miR-26、miR-30、miR-133等數(shù)十種miR在心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[12,13]。其中miR-23a-3p是miR-23家族的重要成員。miR-23a-3p是心肌組織中含量較為豐富的miR之一，miR-23a-3p可以減輕缺血在灌注損傷時心肌細(xì)胞的凋亡[14]。研究表明，miR-23a-3p可以降低超氧化物歧化酶引起的氧化應(yīng)激損傷[15]。既往研究表明miR-30d與心肌細(xì)胞損傷有密切關(guān)系，miR-30d可以被凋亡基因p53激活，并啟動心肌細(xì)胞凋亡過程[16]。

本研究通過比較發(fā)現(xiàn)，STEMI組血漿miR-23a-3p水平顯著低于穩(wěn)定性心絞痛組、健康對照組，miR-30d水平顯著高于穩(wěn)定型心絞痛組、健康對照組，提示miR-23a-3水平下降，miR-30d水平升高與STEMI發(fā)病有關(guān)。分析可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)STEMI發(fā)生后心肌細(xì)胞死亡，miR-23a-3p起到心肌保護(hù)作用而大量消耗，引起血漿miR-23a-3p水平降低；(2)STEMI發(fā)生后心肌出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，miR-23a-3p降低超氧化物歧化酶引起的心肌氧化應(yīng)激損過程中大量消耗，導(dǎo)致其水平降低；(3)miR-23a-3p降低心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致其水平降低；(4)STEMI發(fā)生后，p53激活并進(jìn)一步激活miR-30d，導(dǎo)致血漿miR-30d升高，引起心肌細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示STEMI組血漿LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平顯著高于SAP組、健康對照組。LDH、CK、CK-MB、cTnI是臨床上常用的心肌損傷標(biāo)志物。LDH、CK、CK-MB是重要的催化酶，參與了心肌能量代謝，而cTnI是心肌細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)分子，是保證心肌細(xì)胞完整性的重要蛋白[17]。當(dāng)發(fā)生心肌損傷時，心肌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞膜破裂，LDH、CK、CK-MB、cTnI釋放入血，導(dǎo)致血液中LDH、CK、CK-MB、cTnI水平升高[18]，而SAP患者由于心肌細(xì)胞沒有發(fā)生壞死，因此血漿LDH、CK、CK-MB、cTnI水平與健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NT-proBNP是反映心功能的重要標(biāo)志物，當(dāng)心功能降低時NT-proBNP水平升高[19]。

本研究還對不同心功能STEMI患者血漿miR-23a-3p、miR-30d水平進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示隨NYHA心功能分級的升高，STEMI患者血漿miR-23a-3p水平逐漸降低，miR-30d水平逐漸升高。本研究結(jié)果表明miR-23a-3p水平和miR-30d水平也可以反映心功能情況，當(dāng)NYHA心功能分級的升高時，漿miR-23a-3p水平逐漸降低，miR-30d水平逐漸升高。進(jìn)一步分析顯示miR-23a-3p、miR-30d水平與STEMI患者心功能指標(biāo)和心肌損傷指標(biāo)有很好的關(guān)聯(lián)。由于miRNA在血液中能夠穩(wěn)定存在，且通過qRT-PCR方法檢測miRNA快速、敏感[20]，因此miR-23a-3p、miR-30d可能對STEMI診斷和嚴(yán)重程度評估具有一定價值。本研究顯示miR-23a-3p、miR-30d對STEMI預(yù)測診斷的價值較高AUC均在0.7以上。兩指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用則價值更高，AUC為0.843(0.739～0.962)，提示臨床上通過檢測血漿miR-23a-3p、miR-30d水平，可以為STEMI診斷判斷提供依據(jù)。

綜上所述，STEMI患者血漿miR-23a-3p水平降低，miR-30d水平升高，其水平與心功能標(biāo)志物和心肌損傷標(biāo)志物密切相關(guān)，miR-23a-3p、miR-30d對STEMI診斷和評估具有一定價值。