miR-210在卵巢上皮性癌組織及細胞系中的表達及意義

閆娟 宋玉霞 薛穎 金立娟 閆閃閃

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)中的發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌[1]，據(jù)統(tǒng)計，2016年美國卵巢癌新增病例人數(shù)為22 440例，死亡人數(shù)為14 080例，卵巢癌目前己成為致死率最高的婦科惡性腫瘤[2]，隨著徹底腫瘤細胞減滅術(shù)(R0)+鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療這一治療模式的推廣，卵巢癌的療效獲得了明顯改善，但5年生存率仍低于45%[3]。早期診斷困難及化療耐藥是影響目前卵巢癌臨床療效和預(yù)后的主要原因[4]。雖然多年來通過眾多學(xué)者的努力工作，在原癌基因、抑癌基因和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究等方面做出了不懈的努力，取得了不少成果，但是卵巢癌的發(fā)生及化療耐藥的產(chǎn)生機制仍未完全闡明。近些年一類新的非蛋白質(zhì)編碼microRNAs(miRNAs)的出現(xiàn)，為卵巢癌的研究提供了新思路[5]。miR-210莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列位于11p15.5,并且參與腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲和凋亡[6]。miR-210 在許多腫瘤中表達,有學(xué)者通過基因芯片技術(shù)證明miR-210在卵巢癌組織及細胞系中表達[7]。但是目前miR-210參與卵巢上皮性癌生物學(xué)行為的具體分子機制仍不清楚，我們利用實時定量PCR方法檢測了卵巢上皮性癌組織、正常卵巢組織中，以及卵巢上皮性癌細胞系HO-8910/HO-8910PM、COC1、OVCAR3及SKOV3/SKOV3-TR30/SKOV3-DDP中miR-210的表達，分析miR-210與卵巢癌臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-210的靶基因，分析其參與的信號通路，為研究miR-210與卵巢上皮性癌生物學(xué)行為的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2015年1月在石家莊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)切除的卵巢癌組織共56例，并選取同期因子宮脫垂于我科行全子宮加雙附件切除及術(shù)前BRCA基因檢測突變陽性行預(yù)防性雙附件切除者的卵巢組織33例。納入研究的卵巢癌患者年齡35～75歲，平均年齡(50±12.3)歲；其中<50歲19例，≥50歲37例。根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進行區(qū)分：Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期29例，Ⅳ期8例；漿液性42例，粘液性5例，子宮內(nèi)膜樣5例，透明細胞癌3例，其他類型1例。正常卵巢組患者年齡39～70歲，平均年齡(52±11.6)歲。切除組織于離體30 min內(nèi)留存，經(jīng)液氮冷凍處理后保存于-80℃冰箱內(nèi)。隨訪方式主要為電話隨訪和門診復(fù)查，隨訪截止日期為2020年1月。隨訪截止時仍存活的患者、隨訪過程中失訪的患者均視為截尾數(shù)據(jù)，其生存期為確診至末次隨訪之間的時間；隨訪過程中已死亡的患者視為完全數(shù)據(jù)，其生存期為確診至死亡之間的時間。本研究得到本院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有納入研究的患者簽署知情同意書，并自愿參與本研究。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過病理確診未卵巢癌；②術(shù)前未經(jīng)過放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料及隨訪記錄完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)腫瘤；②合并嚴(yán)重急慢性感染性疾病；③合并心、肝、腎等實質(zhì)性臟器嚴(yán)重功能不全。

1.3 細胞系 高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞系HO-8910PM、人卵巢癌細胞系HO-8910、人卵巢癌細胞系OVCAR3及人卵巢癌細胞系COC1由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所提供；人卵巢癌細胞系SKOV3及其紫杉醇耐藥細胞亞系SKOV3-TR30、順鉑耐藥細胞亞系SKOV3/DDP購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院；人正常卵巢細胞系IOSE386，購自中國醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)健委細胞生物學(xué)重點實驗室。

1.4 主要試劑 細胞培養(yǎng)基RPMI 1640gou購自美國Gibco公司，McCoy’s 5A購自美國Invitrogen公司； M199購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，Trizol購自美國 Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，熒光定量 PCR檢驗試劑盒購自珠海莫納生物科技公司，PCR引物由上海生工生物有限公司合成，qRT-PCR 采用ABI Step One Plus PCR 儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養(yǎng)： HO-8910、HO-8910PM、COC1及 OVCAR3細胞系，采用RPMI 1640培養(yǎng)基；SKOV3、SKOV3-TR30及SKOV3/DDP細胞系，采用McCoy’s 5A培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。IOSE386細胞系采用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)。所有耐藥細胞系均按培養(yǎng)要求加入規(guī)定濃度化療藥物。于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代、培養(yǎng)。

1.5.2 RNA提取及realtime-PCR：按照Trizol說明書對各組組織及細胞行總RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-210上游引物：5’-GGAGATCTGACCAGGTCATTT

GCATAC-3’；下游引物：5’-GGGAATTCGATATGACCA

CACCTGTG-3’；U6：上游引物：5’-GCTTCGGCAOCACA

TATACTAAAAT-3’;下游引物：5’-CGCTTCACGAATTT

GCGTCAT-3’， 應(yīng)用按以下程序進行擴增：預(yù)95℃變性5 min，95℃10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；78℃ 20 s，共40個循環(huán)。將內(nèi)參引物U6與目的基因引物加入同一反應(yīng)體系，反應(yīng)條件相同，每一樣本PCR反應(yīng)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct值進行分析。

1.5.3 靶基因預(yù)測及信號通路分析：利用生物信息學(xué)分析軟件 Target Scan(http:∥ targetscan.org)、miRanda (http:∥www.microrna.org / miranda_new.html) 和 miR Base Targets (http:∥microna．sanger.ac.uk /targets /v4 /) 綜合分析， 選取3種軟件的共同結(jié)果， 作為表達差異 miRNA 的可能靶基因，并通過miRWalk數(shù)據(jù)庫中的KEGG pathway(http:// www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)功能聚類分析miR-210調(diào)控的靶基因及參與的與腫瘤相關(guān)信號通路[8]。

2 結(jié)果

2.1 miR-210在2組組織中的表達 miR-210在卵巢癌組織中的相對表達量為1.539±0.363，顯著高于正常卵巢組織中miR-210的相對表達量(1.017±0.289)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.438,P<0.001)。見圖1。

圖1 miR-210在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達情況

2.2 miR-210在卵巢癌細胞系中的表達 在卵巢癌細胞系及正常卵巢上皮細胞IOSE386,miR-210存在差異表達，與人正常卵巢細胞系IOSE386(1.000±0.043)相比，miR-210在卵巢癌細胞系HO-8910/HO-8910PM、COC1、OVCAR3、SKOV3/SKOV3-TR30/SKOV3-DDP均呈上調(diào)表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.64，P<0.001)。HO-8910 與HO-8910 PM 相比(t=7.328,P=0.0004)，SKOV3 與SKOV3-TR30 相比(t=9.869,P=0.0001)，SKOV3與SKOV-3/DDP相比(t=6.6376，P=0.0006)，miR-210的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 miR-210在卵巢癌細胞系中的表達情況

2.3 miR-210的表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 將卵巢癌組織中的miR-210表達量按照其中位數(shù)分為高表達(n=31)和低表達(n=25)，并對表達水平和卵巢癌患者的臨床病理特征進行相關(guān)性分析。研究結(jié)果表明，miR-210表達與年齡及病理類型無關(guān)(P>0.05)，miR-210與FIGO分期、分化類型存在相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 miR-210表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 miR-210的表達與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 miR-210低表達組患者術(shù)后的3年生存率為80.0%、5年生存率為36.0%，中位生存時間為49個月；miR-210高表達患者術(shù)后的3年生存率為32.3%、5年生存率為25.8%，中位生存時間為23.5個月。經(jīng)過Log-Rank檢驗，miR-210高表達組5年生存率低于低表達組的5年生存率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.380，P=0.020)。見圖2。

2.5 miR-210調(diào)控的靶蛋白及參與的信號通路分析 通過查詢Target Scan、miRanda 和 miR Base Targets數(shù)據(jù)庫，取3個數(shù)據(jù)庫中共同預(yù)測的靶基因作為miR-210的可能靶基因，包括GPD1L、NFKB1、ABCB9、U2AF2、XPA、RAD52、MRE11A、ACVR1B、BDNF、APC、NFKB1、E2F3、ESPL1、EFNA3、NCAM1、PTPN1、PIM1、BDNF、PIM1、HOXA9、FGFRL1、EFNA3、VEGF共23個基因。應(yīng)用miRWalk數(shù)據(jù)庫中的KEGG pathway功能聚類分析miR-210調(diào)控的靶基因參與的與腫瘤相關(guān)的信號通路，可見miR-210參與了包括MAPK信號通路，Wnt信號通路等。見圖3、表3。

圖2 miR-210 高表達組和低表達組患者生存率比較(Kaplan-Meier法)

圖3 miR-210靶基因的預(yù)測結(jié)果分析

表3 miR-210調(diào)控的靶基因參與腫瘤相關(guān)信號通路分析

3 討論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其病死率在女性生殖道腫瘤中居首位，5年生存率長期徘徊在30～45%左右[2]。目前對卵巢癌主要的治療以手術(shù)+鉑類為基礎(chǔ)的化療為主,并輔以放療、靶向治療等，但晚期患者遠期存活率并無明顯改善。其主要原因是：(1)由于卵巢癌患者缺乏早期的典型臨床癥狀，因此大多數(shù)患者在就診時已屬晚期；(2)對化療藥物易產(chǎn)生耐藥。因此對于卵巢癌患者的早期發(fā)現(xiàn)及化療耐藥的預(yù)防及逆轉(zhuǎn)就顯得尤為重要。通過探究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥機制，從而為卵巢癌患者提供新的早期診斷標(biāo)志物和耐藥治療靶點已經(jīng)成為研究者迫切需要解決的問題[9]。

miRNA 是一類長度約20-25個核苷酸的非編碼RNA，以往認為miRNA 無生物學(xué)功能[10]。但隨后研究發(fā)現(xiàn)人類各種類型腫瘤發(fā)生、發(fā)展均與miRNA的異常表達相關(guān)[11]。miRNA可通過調(diào)控其靶mRNA的表達參與腫瘤的生長、侵襲、血管生成和免疫逃避的發(fā)生及進展[12]。miRNA 是通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)互補結(jié)合進而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用，并且同時調(diào)控多個目標(biāo)基因。因此，miRNA在生物體的生理及病理過程中發(fā)揮廣泛作用。目前研究認為：與腫瘤相關(guān)的miRNAs 被分為兩類：抑癌miRNAs 和促癌miRNAs[13]。盡管如此，有關(guān)人類miRNAs 異常表達導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛開始，這是因為一個miRNA可以同時調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以被多個miRNA調(diào)控，miRNA與靶基因之間形成了復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，在卵巢癌患者中，miRNA異常表達參與不同卵巢癌通路在卵巢癌的發(fā)病機制和發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[14，15]。

miR-210 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與缺氧環(huán)境密切相關(guān)的miRNA，其下游靶基因通過調(diào)控細胞周期、分化、凋亡、惡變、糖酵解等過程而發(fā)揮著重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,8]。正因為如此，miR-210成為科學(xué)家關(guān)注的熱點之一。國內(nèi)學(xué)者以miRNA微陣列技術(shù)為平臺,最終篩選了卵巢癌化療耐藥與敏感組織之間表達差異的miRNA,其中在耐藥組織中表達上調(diào)為has-miR-210、has-miR-1307，表達下調(diào)為has-miR-134[7]。本研究通過Real-time PCR方法檢測了卵巢癌組織中miR-210的表達情況，結(jié)果提示與正常卵巢組織相比，miR-210在卵巢癌組織中表達明顯上調(diào)(1.539±0.363 vs 1.017±0.289)，進一步分析顯示卵巢癌組織中miR-210的表達水平與卵巢癌的FIGO分期、分化類型具有明顯相關(guān)性，這提示miR-210的上調(diào)表達可能參與了卵巢癌的疾病進展和腫瘤細胞的分化。同時，我們檢測了卵巢上皮性癌細胞系中miR-210的表達，結(jié)果顯示miR-210在各卵巢上皮性癌細胞系中均高表達，并且卵巢癌耐藥細胞系與各對應(yīng)卵巢癌細胞系miR-210的表達存在明顯差異性，這一結(jié)果提示miR-210可能參與了卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥等各生物學(xué)過程。目前研究認為在絕大多數(shù)腫瘤中，miR-210的表達通常是升高的，例如頭頸部腫瘤、胰腺癌等,這與miR-210能夠促進細胞周期進程有關(guān)[16，17]。研究表明miR-210是缺氧條件下變化最明顯的miRNA，這種過表達可能只是腫瘤乏氧的反應(yīng)，但也有學(xué)者認為miR-210表達有可能參與腫瘤乏氧狀態(tài)下的發(fā)生、發(fā)展[18]。另外，在某些腫瘤中觀察到miR-210表達下降和基因缺失，暗示它具有潛在的抑制腫瘤功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-210能夠明顯地抑制癌細胞生長[19]。根據(jù)這些研究，我們認為miR-210在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用具有多面性，它可能是調(diào)節(jié)細胞自身穩(wěn)態(tài)的重要分子，擾亂細胞內(nèi)miR-210水平將不利于細胞的生存。因此，闡明miR-210參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥的具體分子機制可為卵巢癌早期診斷和治療提供新的靶點。

在我們檢測的多種卵巢上皮性癌細胞系中miR-210均有不同程度的高表達，但是通過比較具有高轉(zhuǎn)移特性的HO-8910PM與親本HO-8910細胞系，miR-210呈下調(diào)表達(35.857VS21.970，P=0.0004)，通過對靶基因的分析可知：miR-210可能調(diào)控ACVR1B，PTPN1，NCAM1，而這些蛋白參與細胞運動生物學(xué)過程，這提示在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展過程中miR-210是一重要的角色。同時，我們對比SKOV3與耐藥細胞系發(fā)現(xiàn)，在耐藥細胞系中miR-210明顯上調(diào)，這一結(jié)果與雙婷等[7]對miR-210在卵巢癌耐藥與敏感組織中的檢測結(jié)果一致，這是否說明miR-210的表達水平差異，參與通過細胞信號通路，改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感度，為此，我們認為進一步研究miR-210在卵巢癌化療耐藥中的機制有重要的意義。

此外，在本研究中，我們對miR-210的表達情況與卵巢癌患者的生存情況進行了分析，結(jié)果表明，miR-210高表達的卵巢癌患者中位生存時間為23.5個月，5年生存率為25.8%；miR-210低表達患者的中位生存期為49個月，5年生存率為36.0%，經(jīng)Log-Rank檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020)，miR-210高表達卵巢癌患者的生存較低表達患者差。Greither等[20]在胰腺癌患者中研究結(jié)果表明miR-210高表達胰腺癌患者的預(yù)后差于miR-210低表達患者，這與我們的研究結(jié)果是一致的。雖然CA125、HE4等腫瘤標(biāo)記物在臨床工作中廣泛應(yīng)用，但其都存在敏感性或特異性不高的問題。因此，目前卵巢癌的診療過程中仍然缺乏較為有效的評價預(yù)后的生物標(biāo)志物，進一步研究miR-210在卵巢癌預(yù)后中的價值可以為卵巢癌的診療過程及預(yù)后判斷提供新分子標(biāo)志物。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示miR-210在卵巢癌組織及卵巢癌細胞系中均表達上調(diào)，其異常表達與卵巢癌患者的年齡及病理類型無關(guān)，與卵巢癌FIGO分期及腫瘤細胞分化程度顯著相關(guān)，并且與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，可以作為預(yù)后判斷指標(biāo)，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，深入研究miR-210在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的詳細分子機制，探討其所起到的作用，可為將來卵巢癌的臨床診斷、治療以及預(yù)后判斷提供詳細的理論依據(jù)。