基于數據庫分析ASF1B在胃癌中的表達與預后的關系

李蒙蒙黃 露李全營密奧寧紀知語秦長江

河南大學淮河醫院 普通外科，河南 開封475000

根據國際癌癥研究機構(IARC)的估計，2018年胃癌的發病率和死亡率較2012 年的統計增加[1]。目前全世界新增胃癌病例占所有確診癌癥的5.7%，死亡率占所有確診癌癥病例的8.2%，是全球第五大最常見的癌癥類型和死亡率僅次于肺癌和結直腸癌的第三大癌癥類型。并且，絕大多數胃癌病例發生在發展中國家[2]。早期診斷、早期治療對于胃癌的預后至關重要，準確的胃癌生物標記物可有助于胃癌的早期診斷和指導治療。

哺乳動物中有兩種ASF1 亞型，分別是ASF1A 和ASF1B，作為組蛋白H3/H4 的伴侶蛋白，為組蛋白H3/H4 提供N-末端作為結合界面[3]。ASF1 編碼的蛋白作為細胞周期調控激酶TLKs家族的底物，chk1 通過調節TLK1 潛在協調ASF1 組蛋白結合能力，并推動DNA 修復過程。在調節核小體結構中確保核小體組裝位點上組蛋白的持續供應[4，5]。腎細胞癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌患者的發生及預后與ASF1B 有密切關系[6-9]。目前ASF1B在胃癌中的表達及預后價值仍不清楚，本研究利用TCGA 數據庫研究ASF1B在胃癌的預后價值和作用通路，并用GEO 數據集驗證結果準確性。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/)中下載407 個胃癌樣本的mRNA 的表達數據(版本為2019-07-20 的Htseq-counts，其中包括375 個腫瘤組織和32 個癌旁樣本)和臨床數據。GEO(Gene Expession Omnibus)數據庫作為驗證組，從中下載433 個胃癌腫瘤組織的mRNA 的表達數據(來自GSE84437 芯片，并進行標準化)和臨床數據。

1.2 方法

運用R3.6.3 版本進行分析，從TCGA 數據庫中提取ASF1B mRNA 的表達量，研究整體和配對癌組織與癌旁組織中的表達是否具有差異，并從gepia2(gepia2.cancer-pku.cn)上驗證。根據ASF1B 表達中位值將TCGA 組和驗證組樣本分為高表達和低表達組，采用Kaplan-Meier 方法分析ASF1B 高低表達的總生存率是否具有差異。采用COX 回歸方法探討實驗組和驗證組中目的基因表達和其他相關臨床因素對總生存期的影響，繪制列線圖以對病人進行較好的個體化預，測并通過計算C-index 驗證預測模型準確度。應用GSEA＿4.0.3 版軟件對實驗組ASF1B 高低之間差異基因進行KEGG 富集分析，將FDR＜25%的基因集作為顯著富集基因集[10]。

2 結果

2.1 ASF1B 基因在胃癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達

在TCGA 組中整體腫瘤組織中ASF1B mRNA 表達明顯高于癌旁組織(P＜0.001)，見圖1A；在gepia2 中得到相似的結果，見圖1B；癌旁組織ASF1B 表達量明顯低于來自同一樣本的腫瘤組織(P＝＜0.001)，見圖2。

圖1 ASF1B 基因mRNA 表達水平分析

圖2 TCGA 中ASF1BmRNA在胃癌組織和配對癌旁正常組織的表達差異

2.2 胃癌患者ASF1B 基因表達水平與預后相關性分析

通過KaPlan-Meier 生存曲線分析ASF1B 表達高低與總體生存率是否具有影響，研究發現ASF1B表達與胃癌患者總體生存率顯著相關，高表達組相對于低表達組具有更高的生存率(P＝0.032)，見圖3A；在驗證組應用同樣的方法進行分析得出相似結果(P＝0.018)，見圖3B。

圖3 ASF1B 高低表達組的總體生存率之間差異

應用COX 比例風險模型分析胃癌患者的臨床病理特征與預后關系。在實驗組中單因素COX 模型分析結果表明，胃癌患者預后與ASF1B 表達顯著相關(P＝0.032，HR＝0.973，95%CI＝0.949～0.998)，此外還分別與年齡、分期、T、M、N 有顯著相關性(P＜0.05)，見圖4A；在驗證組中ASF1B 表達與胃癌患者預后具有顯著相關性(P＝0.004，HR ＝0.785，95%CI＝0.665～0.927)，此外還分別與年齡、T、N 有顯著相關性(P＜0.05)，見圖4B；多因素COX 比例風險模型結果表明實驗組中胃癌患者預后與ASF1B 表達量顯著相關(P＝0.006，HR ＝0.961，95%CI ＝0.934～0.988)，此外還與年齡、性別、M 有顯著相關性(P＜0.05)，見圖5A；在驗證組中胃癌患者預后與ASF1B表達量有顯著相關關系(P＝0.017，HR ＝0.811，95%CI＝0.684～0.963)，此外還與年齡、T、N 有顯著相關性(P＜0.05)，見圖5B。根據多因素COX 比例風險模型構建列線圖，C-指數為0.70，95%CI ＝0.66～0.74，驗證組C 指數為0.68，95%CI ＝0.65～0.72，說明該模型分辨度較好，見圖6。

圖4 單因素COX 回歸分析ASF1B 表達水平和臨床病理因素與預后相關性

圖5 多因素COX 回歸分析ASF1B 表達水平和臨床病理因素與預后相關性

圖6 多因素COX 回歸模型建立列線圖

2.3 ASF1B在胃癌中的相關通路

為了研究ASF1B 基因對于胃癌可能的作用機制，將實驗組胃癌樣本ASF1B 表達量按中位值分為高表達和低表達組，將兩組的表達數據進行了GSEA(Game set enrichment analysis)比較。結果表明，ASF1B 高表達腫瘤樣本在堿基切除修復、細胞周期、同源重組、錯配修復、核苷酸切除修復等生物學過程或通路存在富集。而ASF1B 低表達組在ECM受體相互作用和Hedgehog 信號等信號通路存在富集，見圖7。

圖7 GSEA 分析高低表達組富集的生物學過程及信號通路

3 討論

目前研究表明，ASF1 是組蛋白H3/H4 的伴侶蛋白，參與DNA 復制和修復以及轉錄調控[11]。關于影響胃癌預后因素的包括細胞周期調控因子、微衛星不穩定性(MSI)、細胞凋亡調控因子、DNA 修復等[12]，細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)能夠正向調節細胞周期過程，但過度表達與胃癌的低分化和不良預后有關[13]。而細胞周期蛋白激酶抑制劑P27KiP1 具有減緩甚至停止細胞分裂的功能，研究結果顯示，P27KiP1 低表達與胃癌病人不良預后有關[14]。MSI 主要是由于基因突變造成，最近關于胃癌的突變分析顯示有37 個明顯突變基因，如TP53、KRAS、PIK3 等，而造成高突變性的原因主要是DNA錯配修復的缺陷[15-16]；ASF1 蛋白作為TLKs 家族的底物，而TLK 失活會損害核小體的組裝，并會導致單鏈DNA 斷裂和復制叉停止，最終誘發DNA 損傷反應[17]。

ASF1B在前列腺癌的研究[7]中表明敲除ASF1B 可以通過抑制PIK3/AKT 信號通路從而減少了前列腺癌的增殖，促進了細胞凋亡和細胞周期阻滯，ASF1B 高表達與前列腺癌患者的不良預后有關。在腎透明細胞癌中ASF1B 高表達通過上調PCNA和下調P27 表達促進細胞增殖，上調MMP2 和MMP9 促進細胞遷移，同樣通過AKT 通路促進癌細胞的增殖和遷移[8]。然而，胃癌病人中ASF1B 低表達與患者的不良預后有關，這可能與腫瘤的組織特異性和微環境不同導致ASF1B在胃癌中的作用通路不同有關。通過GSEA 富集分析表明，胃癌病人中ASF1B 高表達主要在調控細胞周期和DNA 錯配修復上存在富集，在調控細胞周期的作用機制可能與P27KiP1 相似，在DNA 錯配修復的生物學過程中可能通過減少基因突變和DNA 損傷反應，進而減少微衛星不穩定性(MSI)[18]。而胃癌病人中ASF1B低表達主要在細胞外基質ECM 受體相互作用和Hedgehog 信號通路上存在富集，腫瘤相關成纖維細胞與巨噬細胞M2 相互作用造成腫瘤微環境TME缺氧，進而導致ECM 的密度和組成發生改變，這一現象造成癌細胞的增殖和遷移[19]。Hedgehog 信號通路在維持胃癌的穩態和腫瘤轉化中有重要作用[20]，Hedgehog 信號通路異常導致在TME 中分泌含有腫瘤相關的成纖維細胞，導致癌細胞增殖和侵襲[21]。

本研究通過TCGA 數據庫首次報道了ASF1B在胃癌患者中的可以作為獨立預后因素，指出ASF1B 低表達與胃癌患者的不良預后有關，并通過了GEO 數據庫驗證；ASF1B在胃癌中具體作用機制及生物學行為需后期通過體內體外實驗進一步研究。