金線蓮醇提物和水提物生物活性研究

陳健敏 劉思彎 冉夢楠 王美霞 劉欣瑩

1.莆田學院 藥學與醫學技術學院，福建 莆田 351100；2.藥物分析與檢驗醫學福建省高校重點實驗室，福建 莆田351100

0 前言

金線蓮(Anoectochilus roxburghii)屬于蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬草本植物，主要分布在我國南方地區，如福建、浙江、廣東、廣西和臺灣等省[1]。它是一種傳統的珍貴中草藥，具有清熱涼血、祛風利濕等功效[2]。現代藥理試驗研究表明，它在治療肝病、糖尿病、腫瘤、高脂血癥、痛風性關節炎、類風濕性關節炎和關節炎等疾病中表現出一定的藥理活性[3]，可能是因為其富含黃酮類、酚類、多糖類和內酯苷類等物質[4]。如何有效提取這些活性成分，充分發揮金線蓮的藥效，是金線蓮相關產品開發的關鍵。目前，文獻對有機溶劑提取黃酮類成分或采用水為溶劑提取多糖類成分進行生物活性研究，而對醇提物和水提物中成分含量及活性的差異的比較研究較少。然而，通過比較研究醇提物或水提物中成分和活性的差異，對于金線蓮資源的利用十分重要。因此，本研究分別以乙醇和水作為溶劑，制備金線蓮的醇提物和水提物，比較兩種提取物中總黃酮和總酚的含量差異，并對兩種提取物的抗氧化能力、酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性進行研究。研究結果表明，醇提物中的總黃酮和總酚含量均高于水提物，在抗氧化能力和酪氨酸酶抑制方面醇提物都具有更強的活性。值得注意的是，本研究為金線蓮相關產品的研究開發提供了理論支持。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

BSM 分析天平，上海卓精科技有限公司；UV-2500 紫外可見分光光度計，日本津島；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；Milli-QPlus 超純水發生器，德國賽多利斯；SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵，鄭州特爾儀器設備有限公司；RE-52 型旋轉蒸發儀，上海央申科技儀器公司。

1.2 實驗材料

金線蓮干植株由福建省莆田市仙游縣白洋村金線蓮基地贈予。酪氨酸酶(來源于蘑菇，批號：J417049，比活力為500 U/mg)、抗壞血酸(批號：MB4168)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(批號：M07334)、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(批號：L1619007)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)(批號：I1721068)、無水乙醇(批號：J20202254)、黃嘌呤氧化酶(來源于硫酸銨懸浮液，批號：SLBW8163)比活力為0.5 U/mg)、左旋多巴(批號：J1417049)、L-酪氨酸(批號：H1408317)、三氯化鐵(Ⅲ)六水合物(批號：C1709031)、單寧酸(批號：F1705100)、磷鉬酸(批號：R21257)、鎢酸鈉二水合物(批號：F1715066)、磷酸(批號：D150808)、沒食子酸(批號：F1719036)、福林酚試劑(批號：HF201910327)和蘆丁三水合物(批號：K1618018)均購自上海晶純生化科技股份有限公司。

2 方法

2.1 金線蓮提取物的制備

金線蓮醇提物和水提物的制備采用參考文獻中的方法[5-6]，并做一些調整。醇提物的制備：將金線蓮干植株粉碎，過3 號篩，稱取干燥恒重的金線蓮粉末20 g，按料液比1 g ∶10 mL 加入體積分數為80%的乙醇浸泡，將沉淀物重復浸泡3 次，每次24 h，3次的浸出液合并，水浴溫度設為45 ℃，通過旋蒸濃縮至50 mL 后，取出濃縮液于60 ℃真空干燥箱烘干，收集研磨成粉末狀即得金線蓮醇提物。水提物的制備：將金線蓮干植株粉碎，過3 號篩，稱取干燥恒重的金線蓮粉末20 g，按料液比1 g ∶10 mL 加入蒸餾水浸泡，放置過夜，于80 ℃水浴中回流3 次，每次1 h，過濾，合并各次濾液，旋轉蒸發成浸膏，取出后于60 ℃真空干燥箱干燥24 h，即得金線蓮水提物。產率采用提取物的重量除以金線蓮粉末的重量(20 g)來計算。

2.2 金線蓮提取物中總黃酮的含量測定

在堿性溶液中，黃酮分子結構中的A 環上3 位和5 位羥基以及B 環上的鄰苯二羥基與三價鋁離子會顯色[7]，因此可用三氯化鋁顯色法測定金線蓮提取物中總黃酮的含量。分別取不同濃度的蘆丁對照物質溶液或提取物溶液100 μL 于10 mL 容量瓶中，先加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，室溫下放置6 min 后，加入0.4 mL 10%三氯化鋁溶液，室溫下放置6 min 后，加入3.2 mL 氫氧化鈉溶液，用體積分數為80%乙醇溶液定容至刻度，室溫下放置10 min，在505 nm 處測定其吸光度A1；取蘆丁對照物質溶液或提取物100 μL 于10 mL 容量瓶中，以體積分數為80%乙醇溶液定容至刻度，在505 nm 處測定其吸光度A2；根據制備A1樣品的步驟，不加蘆丁對照物質溶液或提取物，其他條件不變，測定其吸光度A3。最終得到扣除背景的吸光度A＝A1-A2-A3。以蘆丁樣品的吸光度A 為縱坐標，相應濃度為橫坐標，計算得到總黃酮含量測定的回歸方程：Y＝0.010 6X＋0.050 4(R2＝0.991 5)，結果表明，蘆丁在24～128 μg/mL 范圍內線性良好。以金線蓮提取物樣品測得的吸光度帶入方程計算，可得提取物中總黃酮的含量。

2.3 金線蓮提取物中總酚的含量測定

在堿性條件下，多酚類物質可以把福林-肖卡試劑中的磷鎢酸和鉬酸還原，生成藍色混合物，在一定范圍內，其吸光度與總酚含量呈線性關系[8]，因此可用福林-肖卡試劑測試金線蓮提取物中的總酚含量[9]。以沒食子酸為對照物質，其標準曲線的繪制方法如下：吸取0、5、10、20、30 和50 mg/L 沒食子酸標準溶液0.5 mL 分別置于10 mL 試管中，分別加入1.0 mol/L 的福林酚試劑0.73 mL，在1 min 內加入30.00 g/L 的碳酸鈉溶液4 mL，45 ℃水浴中避光顯色112.0 min，于765 nm 處測定溶液吸光度，以測定的吸光度為縱坐標，以相應濃度為橫坐標，得到線性回歸方程，Y＝0.141 2X-0.006 9(R2＝0.998 1)。提取物的測定：取0.5 mL 提取物溶液(1.25 mg/mL，預實驗結果得出)，采用標準曲線中的測定方法測定，每個樣品進行3 次平行實驗(n＝3)，將吸光度代入回歸方程，可計算出提取物相應的沒食子酸含量。

2.4 金線蓮提取物的抗氧化能力測試

以抗壞血酸作為對照物質，采用ABTS、DPPH 和FRAP 三種方法測定金線蓮提取物的抗氧化能力。ABTS 與過硫酸鉀溶液混合后形成藍色的ABTS＋陽離子自由基，在抗氧化劑存在時，自由基被清除而導致溶液退色，利用該原理可以測定物質的抗氧化能力。將不同濃度的提取物溶液與2 mL ABTS＋工作液(混合前0 min 測定734 nm 吸光度A0)混合，10 min 后在734 nm測定吸光度值A10，可計算自由基清除率(%)＝[(A10-A0)/A0]×100%[10]。DPPH 自由基有單電子，在517 nm 處有一強吸收，其醇溶液呈紫色；抗氧化劑會與單電子配對而使DPPH在517 nm 吸收消失，其褪色程度與其自由基清除能力和濃度呈正相關，可利用此原理測定物質的抗氧化能力。分別將不同濃度的100 μL提取物溶液及2 mL DPPH 溶液(0.1 mmol/L)加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min 后測定其吸光度A1，同時測定100 μL 溶劑與2 mL DPPH 溶液混合后的吸光度A2，以及100 μL 測試樣品溶液與2 mL 無水乙醇混合后的吸光度A3。在517 nm 處讀取吸光度后，可計算清除率＝[1-(A1-A3)/A2)]×100%[11]。酸性條件下抗氧化劑可以還原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3＋-TPTZ)產生藍色的Fe2＋-TPTZ[12]，可以據此測試物質的抗氧化能力。取3.3 mL 的緩沖液，向其中加入330 μL的FeCl3溶液(20 mmol/L)，加入330 μL 的TPTZ 溶液(10 mmol/L)，混合均勻，在37 ℃恒溫孵育5 min。再加入330 μL 的樣品，在37 ℃恒溫反應15 min 后，在波長為593 nm 處測定其吸光度值。與對照物質溶液比較，吸光度值高的抗氧化能力強。

2.5 酪氨酸酶活性抑制試驗

在生物體內，酪氨酸酶能催化酪氨酸轉化為多巴(單酚酶活性)，再將多巴氧化為多巴醌(雙酚酶活性)，而多巴醌在475 nm 處有較強的吸收。因此，分別以酪氨酸和多巴作為底物，檢測多巴醌形成的速率便可以測試樣品溶液對酪氨酸酶活性的影響。測定酪氨酸酶單酚酶活性以0.5 mmol/L 酪氨酸為底物，測定酪氨酸酶雙酚酶活性以0.5 mmol/L多巴為底物，均用0.05 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH ＝6.8)配制[13]。測定酪氨酸酶單酚酶活性時，在比色皿中，依次加入2.8 mL 酪氨酸、100 μL 不同濃度的待測樣品溶液(曲酸和金線蓮提取物)和100 μL 酪氨酸酶(1 000 U/mL)，加入酶后開始計時，測定30 min 內每分鐘在475 nm 處的吸光度值；測定酪氨酸酶雙酚酶活性時，取試管A1、A2和A3，分別加入2.8 mL 底物溶液，32 ℃預熱10 min 后，A2和A3加入100 μL 待測樣品溶液，A1加入等體積溶劑。混勻后，A1，A2加入100 μL 酪氨酸酶(400 U/mL)溶液，A3加入100 μL 相應的磷酸緩沖溶液，搖勻，反應10 min 后測定475 nm 處的吸光度值。根據公式，酶活性＝[(A2-A3)/A1]×100%，計算出相應樣品溶液下的相對酶活性。

2.6 黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗

黃嘌呤氧化酶既能催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進而催化黃嘌呤生成尿酸，又能直接催化黃嘌呤生成尿酸；通過抑制其活性能夠降低血液中尿酸的濃度，從而治療尿酸過高引起的痛風等疾病。因此，以黃嘌呤作為底物，通過黃嘌呤氧化酶抑制試驗測試金線蓮提取物是否能夠抑制黃嘌呤氧化酶，是否具備治療痛風的潛力[14]。取四支試管，標記為A1、A2、A3和A4，分別都加入2.7 mL 底物(0.1 mmol/L 黃嘌呤)溶液后，A2和A3加入100 μL 提取物溶液，A1和A4加入等體積DMSO。混勻后，A1，A2加入200 μL黃嘌呤氧化酶(0.04 U/mL)溶液，A3和A4加入200 μL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液(pH＝7.58)，搖勻，反應10 min 后測定290 nm 處的吸光度值[15]。根據公式，酶活性(%)＝ [(A2-A3)/(A1-A4)]×100%，計算出相應樣品下的酶活性。

2.7 數據統計分析

所有試驗數據均重復3 次(n＝3)，采用Microsoft Office Excel 2007 數據分析工具進行處理，并用Duncan多重比較(SSR 法)檢驗各處理平均數之間的差異顯著性(P＜0.05)。試驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用Origin Pro 8.5 軟件作圖。

3 結果與討論

3.1 金線蓮提取物及產率

金線蓮醇提物為棕褐色粉末，具有中藥的芳香氣味，產率為11.01%。本研究中醇提物的產率遠高于文獻報道的2.27%[16]，主要原因可能是提取工藝和乙醇濃度的差異，文獻中是先采用水提取后再醇提，可能有一部分既可溶于水又可溶于醇的物質已在水提物中。金線蓮水提物因其中含有較多糖分，無法完全干燥，表現為棕褐色半固體浸膏，同樣具有中藥的芳香氣味，產率為17.31%。本研究所得的水提物產率大大低于文獻報道的33%[17]，主要原因可能是投料量、提取溫度和提取時間的差異導致。總之，影響提取物產率的因素較多，包括金線蓮品種、溶劑濃度、提取溫度、提取時間和料液比等，所得到的成分也有較大差異[18]。因此，在不同工藝條件下，比較金線蓮醇提物和水提物的成分和藥理活性差異，對金線蓮的進一步開發利用十分重要。

3.2 金線蓮提取物中總黃酮和總酚的含量

以蘆丁為對照物質測定金線蓮提取物的總黃酮含量，發現醇提物中含量為8.11 mg/g，水提物中含量低于方法檢測限，無法測得；可能是因為黃酮類化合物一般難溶或不溶于水，所以一般采用有機溶劑提取總黃酮。文獻報道12 批金線蓮總黃酮的含量在3.89～15.17 mg/g 的范圍內[19]，本研究測得的總黃酮含量在此范圍內。不同來源、批次的金線蓮的總黃酮有一定的差異，可能與其生長年限和生長環境、提取工藝等因素有關[20-21]。以沒食子酸作為對照物質測定金線蓮提取物的總酚含量，結果發現醇提物中含量為4.19 mg/g，而水提物中含量為1.22 mg/g，表明大部分酚類物質仍是較易溶于有機溶劑中。金線蓮醇提物和水提物中總酚含量具有較大差異，目前國內外未見報道。雖有文獻[22]報道金線蓮中的總酚含量為4.1 mg/g，但并未提到采用何種溶劑提取。可以看出，這一數值與本研究的醇提物結果非常一致。

3.3 金線蓮提取物的抗氧化能力

采用ABTS、DPPH 和FRAP 三種常用的方法測試金線蓮提取物的抗氧化能力，結果見圖1。

圖1 金線蓮醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）的抗氧化能力測定

從圖1A 可以看出，金線蓮醇提物(Ethanol extracts)在各個不同的濃度下，其ABTS 自由基清除能力均顯著高于水提物(Water extracts)，當二者濃度達到10 mg/mL 時，清除率分別為(62.00±4.36)%和(14.88±3.36)%，表明醇提物的抗氧化能力約為水提物的4.2 倍。DPPH 測試結果顯示(圖1B)，每個測試濃度點，醇提物的清除率同樣顯著高于水提物(P＜0.05)，分別為(68.69±5.32)%和(11.67±3.25)%。FRAP 測試的結果(圖1C)同樣表明，在每個濃度點，醇提物比水提物具有更高的還原能力，即具有更強的抗氧化能力。以抗壞血酸作為對照物質，以濃度為橫坐標，清除率或OD 值為縱坐標，繪制標準曲線，將三種方法測試的提取物的清除率或OD 值代入標準曲線，即可算出提取物的抗壞血酸當量(Ascorbic acid equivalent weight，mg/g)，如圖1D 所示。結果表明，ABTS 測試的醇提物的抗壞血酸當量為31.66 mg/g，即每克醇提物相當于31.66 mg 的抗壞血酸，醇提物的當量是水提物(6.10 mg/g)的5.2 倍。DPPH 和FRAP 的測定結果表明，金線蓮醇提物當量分別是水提物的8.76 和4.06倍。雖然本研究中金線蓮醇提物和水提物都表現出較強的抗氧化能力，但均略低于文獻報道的抗壞血酸當量(70.38 mg/g)[23]，可能是因為試驗方法和提取工藝的差異所致。綜上所述，金線蓮醇提物的抗氧化能力顯著強于水提物，主要原因可能是醇提物中的總酚含量(4.19 mg/g) 高于水提物(1.22 mg/g)，因為酚類物質的含量可影響提取物的抗氧化能力[24]，其含量越高抗氧化能力越強。

3.4 金線蓮提取物對酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是一種多功能含銅酶，能夠催化酪氨酸生成多巴(單酚酶活性)，接著催化多巴轉化為多巴醌(雙酚酶活性)，多巴醌可以自發聚合形成黑色素[25]。過度的黑色素沉著會引起一些皮膚病(黃褐斑、雀斑和老年斑等)，同時酪氨酸酶也與神經退行性疾病有關，如阿爾茨海默癥和帕金森病等，因此酪氨酸酶抑制劑可成為治療這類疾病的藥物[26]。金線蓮醇提物對酪氨酸酶單酚酶活性的作用如圖2A所示，隨著醇提物濃度的增大，酶促反應的速率顯著下降(直線的斜率)，當濃度達到60 mg/mL 時，以30 min 的數據計算的酶活性下降到37.8%，表明醇提物具有較強的單酚酶抑制活性。有趣的是，醇提物濃度(20 和40 mg/mL)較低時，在10 min 之前，醇提物對單酚酶不僅沒有抑制作用，反而表現出激活的作用，很可能是因為醇提物中酚類物質被酪氨酸酶氧化，氧化產物在475 nm 處也有吸收而引起的。從圖2B 可以看出，水提物在高濃度也具有一定的單酚酶活性抑制作用，然而與醇提物相比，抑制作用相對較弱。

圖2C 顯示了曲酸(Kojic acid)的雙酚酶抑制活性，作為陽性對照。如圖2D 所示，金線蓮醇提物對酪氨酸酶的雙酚酶活性同樣表現出抑制作用，隨著濃度的增大，酶活性逐漸下降，當濃度達到60 mg/mL 時，酶活性只剩下52.2%；而水提物的抑制作用仍然不明顯，低濃度下酶活性都高于100%，主要是因為提取物中存在可以被氧化的酚類物質。導致醇提物和水提物酪氨酸酶活性抑制水平差異的主要原因可能是由于醇提物中含有大量的黃酮類化合物(8.11 mg/g)，而水提物中檢測不到，因為黃酮類化合物被證明具有抑制酪氨酸酶活性的作用[27]。已有報道[27]證明，金線蓮能抑制人黑色素瘤A375 細胞的酪氨酸酶活性以及黑色素合成，同樣能抑制斑馬魚的黑色素生成[28]。本研究通過體外試驗法進一步對其酪氨酸酶活性抑制作用進行了確證。綜上所述，金線蓮醇提物對酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，有潛力成為酪氨酸酶相關疾病的輔助治療藥物。

圖2 金線蓮醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）對酪氨酸酶的作用

3.5 金線蓮提取物對黃嘌呤氧化酶活性的影響

黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝的關鍵酶，可催化嘌呤代謝的兩個步驟(次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸)，而尿酸的過度分泌或排泄不足會引起高尿酸血癥，繼而引發痛風，因此抑制黃嘌呤氧化酶的活性成為治療高尿酸血癥等疾病的關鍵[29]。因此，本研究評價了金線蓮提取物對黃嘌呤氧化酶活性的影響，結果如圖3 所示。圖3A 和圖3B 均表明金線蓮的醇提物和水提物對黃嘌呤氧化酶的活性均沒有表現出抑制作用。然而，已有臨床研究[30-31]表明，金線蓮對高齡老年人高尿酸血癥具有明顯的治療效果。不僅如此，另有研究[14]表明，金線蓮的醇提物和水提物均對黃嘌呤氧化酶有抑制作用，金線蓮水提物對黃嘌呤氧化酶抑制的活性較高，濃度為1 mg/mL 時的抑制率高達96.7%，金線蓮醇提物濃度為1.6 mg/mL 時的抑制率為75.7%。本研究的結果與目前文獻報道的結果不一致，其原因尚不明確，因此需要有更多的試驗來研究金線蓮對黃嘌呤氧化酶活性的影響，以確定金線蓮是否具備治療高尿酸血癥的潛力。

圖3 金線蓮醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）對黃嘌呤氧化酶的作用

4 結論

本研究比較研究了金線蓮醇提物和水提物中總黃酮和總酚的含量差異，并分析了抗氧化能力及其對酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶活性影響的差異。結果發現，金線蓮醇提物中總黃酮(8.11 mg/g)和總酚(4.19 mg/g)的含量均遠高于水提物；三種抗氧化測試方法的測試結果一致，表明醇提物抗氧化能力強于水提物，約為4～8 倍；酪氨酸酶活性抑制試驗表明醇提物對單酚酶和雙酚酶均有抑制作用，而水提物未表現出明顯的抑制作用；黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗表明金線蓮提取物對其活性沒有影響，這與文獻報道的結果不符，仍有待進一步驗證。總之，上述結果表明醇提物因其中富含黃酮類和酚類物質，在抗氧化能力和酪氨酸酶抑制方面具有較強的優勢，為進一步開發金線蓮相關產品提供了理論依據和數據支持。