基于HPLC-MS/MS技術(shù)快速鑒定靈芝化學(xué)成分

姬利強(qiáng) 李山雷 王運(yùn)杰姬世顯王宏琳李昌勤

1.河南大學(xué)國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開(kāi)封 475004；2.河南龍豐食用菌產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，河南 濮陽(yáng) 457300；3.開(kāi)封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封475004

靈芝(Ganoderma)，又被稱為瑞草、神芝、仙草和瑤草等，為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss，exFr.) karst 或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實(shí)體[1]。靈芝是我國(guó)重要的藥食兩用食用菌，其資源豐富，主要分布于浙江、江西、貴州、云南、福建等地。靈芝含有多種化學(xué)成分，活性成分以三萜類、多糖類、氨基酸、核苷類、甾醇類、黃酮類為主[2-5]。在我國(guó)，靈芝已有兩千多年的藥用歷史。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[6-8]表明，靈芝具有抗癌、保肝、降糖、抗炎、抗氧化、抗衰老等多種藥理活性。

到目前為止，靈芝中600 多種化合物已被分離和鑒定，其中三萜類化合物種類最多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和鑒定出300 多種[9]。靈芝化合物種類繁多，藥理活性復(fù)雜。本研究擬采取HPLc-MS/MS 方法對(duì)其化學(xué)成分開(kāi)展研究，為探明靈芝的藥效物質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜(Waters 2D UPLC，Waters，USA)，高分辨質(zhì)譜(Q Exactive，Thermo Fisher Scientific，USA)，色譜柱：Hypersil GOLD aQ 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，Thermo Fisher Scientific，USA)，低 溫 高 速 離 心 機(jī)(Centrifuge 5430，Eppendorf)，渦旋儀(QL-901，其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó))，純水儀(Milli-Q Integral，Millipore Corporation，USA)，冷凍真空濃縮儀(Maxi Vacbeta，GENE COMPANY)。

1.2 藥品與試劑

靈芝(河南龍豐實(shí)業(yè)股份有限公司)，內(nèi)標(biāo)：d3-Leucine，13C9-Phenylalanine，d5-Tryptophan，13C3-Progesterone。甲醇(A454-4)、乙腈(A996-4)均為L(zhǎng)cMS 級(jí)別(Thermo Fisher Scientific，USA)；甲酸氨(17843-250 G，Honeywell Fluka，USA)，甲酸(50144-50 mL，DIMKA，USA)，水由純水儀提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD aQ 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，Thermo Fisher Scientific，USA)；流動(dòng)相為含0.1%甲酸的水溶液(A 液)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B液)；采用以下梯度進(jìn)行洗脫：0～2 min，5% B 液；2～22 min，5%～95% B 液；22～27 min，95% B 液；27.1～30min，5% B 液；流速為0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量為5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

利用Q Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜掃描質(zhì)核比范圍為150～1500 μ，一級(jí)分辨率為70 000，AGC 為1e6，最大注入時(shí)間(IT，injection time)為100 ms。按照母離子強(qiáng)度，選擇Top3 進(jìn)行碎裂，采集二級(jí)信息，二級(jí)分辨率為35 000，AGC 為2e5，最大注入時(shí) 間(IT，injection time) 為50 ms，碎 裂 能 量(stepped nce)設(shè)置為：20，40，60 eV。離子源(ESI)參數(shù)設(shè)置：鞘氣流速(Sheath gas flow rate)為40 單位，輔助氣流速(Aux gasflow rate)為10 單位，噴霧電壓(Spray voltage(｜KV ｜))正離子模式為3.80，負(fù)離子模式為3.20，離子傳輸管溫度(Capillary temp)為320 ℃，輔助氣加熱溫度(Aux gas heater temp)為350 ℃。

2.2 供試品溶液的制備

稱取干燥靈芝100 g，使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后，加10 倍量體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇冷浸2 次，每次3 d，過(guò)濾，合并濾液濃縮并凍干。凍干粉末稱重得12.8 g，得率為12.8%。稱量樣品50 mg。將樣品送至華大基因公司進(jìn)行成分檢測(cè)。

2.3 MS 數(shù)據(jù)分析

本研究采用(Waters 2D UPLC waters，USA)串聯(lián)Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)來(lái)進(jìn)行代謝物的分離和檢測(cè)。使用華大高分辨植物代謝數(shù)據(jù)庫(kù)(BGI High Resolution Accurate Mass Plant Metabolome Database，BGI HRAM-PMDB)(植物代謝物2 500＋)和mzCloud(化合物17 000＋，內(nèi)源性代謝物3 000＋)兩大標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分鑒定。

2.4 化學(xué)成分分析結(jié)果

按上述“2.1”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，獲得正、負(fù)離子模式下靈芝50%醇提物溶液的HPLC-MS/MS TIC 色譜圖。按“2.3”項(xiàng)下MS 數(shù)據(jù)分析方法解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)靈芝50%醇提物的化學(xué)成分進(jìn)行快速比對(duì)分析，共鑒定出化學(xué)成分85 個(gè)，見(jiàn)表1。按化合物類型分類，包括黃酮類7個(gè)，生物堿類3 個(gè)，苯丙素類5 個(gè)，萜類13 個(gè)，甾類3 個(gè)，酚類3 個(gè)，糖類2 個(gè)，核苷類12 個(gè)，氨基酸類6 個(gè)，脂肪酸類4 個(gè)，有機(jī)酸類10 個(gè)，其他類成分17 個(gè)。

表1 靈芝50%醇提物化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3 討論

本研究采用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)靈芝子實(shí)體的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取物通過(guò)ESI＋、ESI-兩種離子模式來(lái)進(jìn)行了化學(xué)成分研究，以此提高化學(xué)成分的覆蓋度。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)保留時(shí)間(RT)、一級(jí)質(zhì)譜(MS)、二級(jí)質(zhì)譜(MS2)信息，初步得到以下結(jié)果：黃酮類7 個(gè)，生物堿類3 個(gè)，苯丙素類5 個(gè)，萜類13 個(gè)，甾類3 個(gè)，酚類3 個(gè)，糖類2 個(gè)，核苷類12 個(gè)，氨基酸類6 個(gè)，脂肪酸類4 個(gè)，有機(jī)酸類10 個(gè)，其他類成分17 個(gè)。其中萜類物質(zhì)是靈芝中的主要藥效活性物質(zhì)[10-12]，鑒定得到的三萜化合物有靈芝酸(Ganoderic acid C6)、Tsugaric acid A 等。靈芝酸為含有羧基的三萜。這些化合物通常具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、分子量和高親脂性。靈芝三萜具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抑菌及抗病毒的作用[13-15]。靈芝中含有具廣泛生理活性的核苷水溶性成分，實(shí)驗(yàn)鑒定得到的核苷類成分包括尿嘧啶(Uracil)、尿嘧啶核苷(Uridine)、腺嘧啶(Adenine)、腺嘌呤核苷(Adenosine)、鳥(niǎo)嘌呤(Guanine)、鳥(niǎo)苷和腺苷等[16]。靈芝中生物堿含量雖然較低，但有些具有重要的生理活性。生物堿能增加冠狀動(dòng)脈血流量、增強(qiáng)心肌和肌體對(duì)缺氧的耐受性，臨床上對(duì)心腦血管疾病、肌無(wú)力等疾病有一定的療效[17]。甾醇是靈芝的脂溶性成分，含量比較高。此外從靈芝中還得到大量的氨基酸、脂肪酸類、有機(jī)酸類等其他化合物。

靈芝作為我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有很高的藥用價(jià)值，但我國(guó)目前靈芝產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)利用狀況仍處于初級(jí)階段。靈芝中活性成分極其復(fù)雜，既快又準(zhǔn)確地鑒定分離出活性成分的方式仍需深入研究。