梁靜，趙紅丹，高福蓮，李晉雪

新鄉醫學院第三附屬醫院1皮膚科，2腫瘤科，河南 新鄉 453000

3新鄉醫學院基礎醫學院，河南 新鄉 453000

皮膚基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC） 好發于人體頭面部，是最常見的惡性腫瘤之一。中國BCC發病率較低，每年約1.1/10萬，受人們生活習慣的影響，近年來BCC的發病率逐漸上升。早期BCC可表現為隆起、丘疹、結節或斑塊，影響美觀，雖然遠處轉移率較低，但會對患者造成一定困擾，部分晚期BCC患者易發生侵襲和轉移，但目前BCC的發病機制尚不明確。細胞凋亡是一種受基因調控的自主死亡方式，逃避凋亡是腫瘤形成的重要原因之一。caspase 8可對機體細胞多個生物學活動進行調節，其中最主要的功能就是調節細胞凋亡。既往研究表明，caspase 8不僅可對細胞程序性凋亡及壞死性凋亡過程進行調控，還可以通過調節一系列基因的表達來調控細胞黏附、遷移等過程，在抑制腫瘤形成中發揮重要作用。DOC-2/DAB2結合蛋白（DOC-2/DAB2 interacting protein，DAB2IP）是大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）-鳥苷三磷酸酶激活蛋白家族成員之一。DAB2IP最顯著的特征在于其特有的RASGAP同源結構域可以特異性調節RAS介導的一系列信號轉導通路；同時，DAB2IP的C2結構域也可以通過與凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）結合，從而發揮促凋亡作用，因此，DAB2IP又被稱為ASK1結合蛋白（ASK1-interacting protein 1，AIP1）。有研究發現，大部分腫瘤組織中，表觀遺傳學調控抑制了DAB2IP的表達，膀胱癌中啟動子甲基化和組蛋白修飾會抑制DAB2IP的表達，表明

DAB2IP

可能作為抑癌基因，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移過程。本研究探討DAB2IP、caspase 8在BCC中的表達情況及作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2019年7月新鄉醫學院第三附屬醫院收治的BCC患者。納入標準：①均經病理學檢查確診為BCC；②無其他任何皮膚疾病；③無其他系統性疾病或惡性腫瘤；④病歷資料完整。排除標準：①術前未接受系統治療；②皮膚科和病理科醫師在復核診斷過程中未達成一致意見的患者。依據納入和排除標準，本研究共納入80例BCC患者，其中男36例，女44例；年齡26～79歲，平均（59.3±11.5）歲。同期選取30例接受整形外科手術的健康者，其中男13例，女17例；年齡31～69歲，平均（55.2±12.1）歲。取80例BCC患者手術切除的BCC組織，取30例健康者的正常皮膚組織，皮膚組織均取自頭面部。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 人BCC細胞系TE-354.T購自北京中源合聚生物科技有限公司。

DAB2IP

抑制物（si-DAB2IP）、陰性對照（si-NC）均購自上海吉瑪生物有限公司，細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自購自美國Thermo Fisher Scientific公司，組織RNA提取Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）熒光定量試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司，兔抗人DAB2IP、caspase 8抗體均購自美國Abcam公司。所有目的基因引物均由廣州銳博生物科技有限公司合成。1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）檢 測

DAB 2IP

mRNA的相對表達量 取BCC組織和正常皮膚組織充分研磨后，按照Trizol試劑盒說明書提取組織中的總RNA，轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA）。按照RT-PCR試劑盒說明書將所需試劑依次加入實時熒光定量PCR中進行擴增。

DAB2IP

mRNA的相對表達量采用2法計算。

DAB2IP

上游引物：5'-CTGAGCGGGATAAGTGGATGG-3'，下游引物：5'-AAACATTGTCCGTCTTGAGCTT-3'；

GAPDH

上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物 ：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.3 細胞轉染和分組 按照細胞轉染試劑盒Lipofectamine 2000操作說明，分別將si-DAB2IP、si-NC通過脂質體轉染至BCC細胞系TE-354.T，分別作為si-DAB2IP組和si-NC組，置于37℃條件下培養48 h，用于后續實驗。

1.2.4 蛋白質印跡（Westernblot）法檢測DAB 2IP、caspase8蛋白的相對表達量 取適量BCC組織、正常皮膚組織、si-DAB2IP組細胞、si-NC組細胞，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）組織裂解液，充分研磨后，離心提取上清液中的蛋白。取適量提取的蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDSPAGE）進行分離，用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進行濕法轉膜，加入 DAB2IP、caspase 8一抗（稀釋濃度為1∶1000）孵育2 h，5%的牛奶固定，4℃環境下孵育過夜，次日37℃搖床復溫1 h，加入二抗繼續孵育1 h。洗膜后電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法顯影，以β-actin為內參，Image J軟件分析條帶灰度值，計算DAB2IP、caspase 8蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP mRNA相對表達量的比較

BCC組織中

DAB2IP

mRNA的相對表達量為（0.56±0.24），明顯低于正常皮膚組織中的（2.31±1.12），差異有統計學意義（

t

=13.278，

P

＜0.01）。

2.2 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP、caspase8蛋白相對表達量的比較

BCC組織中DAB2IP、caspase 8蛋白的相對表達量均明顯低于正常皮膚組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP、caspase 8蛋白相對表達量的比較（x-± s）

2.3 抑制DAB 2IP基因的表達對BCC細胞DAB 2IP、caspase8蛋白表達的影響

抑制

DAB2IP

基因的表達后，si-DAB2IP組細胞中DAB2IP、caspase 8蛋白的相對表達量均明顯低于si-NC組，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 si-DAB 2IP組和si-NC組BCC細胞DAB 2IP、caspase 8蛋白相對表達量的比較（±s）

2.4 不同臨床特征BCC患者BCC組織中caspase8、DAB 2IP蛋白相對表達量的比較

不同性別、年齡BCC患者BCC組織中caspase 8、DAB2IP蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中DAB2IP蛋白相對表達量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，差異均有統計學意義（

t

=5.856、2.150，

P

＜0.05）；腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中caspase 8蛋白相對表達量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，差異均有統計學意義（

t

=3.121、2.250，

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征BCC患者BCC組織中DAB 2IP、caspase 8蛋白的相對表達量（ n=80）

2.5 相關性分析

Pearson相關分析結果表明，BCC組織中caspase 8的表達與DAB2IP的表達呈正相關（

r

=0.72，

P

＜0.05）。

3 討論

基底細胞癌對人體頭面部組織破壞性較強，過度的日光照射是BCC發生的最主要原因。歐美白色人種是BCC的高風險人群，有研究表明，歐美白色人種患BCC的風險超過30%。目前，BCC的治療方案仍以手術和放療為主，尚無特異性的治療方案。

DAB2IP

位于人類染色體9q33.1～q33.3，包含15個外顯子和14個內含子，編碼967個氨基酸，長度96 kb左右，分子量110 kD。2002年，DAB2IP首次在膀胱癌細胞中被確定為一種DOC-2/DAB2結合蛋白，具有調節細胞存活、增殖、凋亡、上皮-間充質轉化、腫瘤干細胞形態、放化療耐受性的作用，還能抑制膀胱癌細胞的生長。隨后，DAB2IP在腫瘤中的功能被廣泛研究。Calvisi等的研究發現，抑制肝癌細胞中DAB2IP的表達可以明顯促進肝癌細胞的增殖。Yang等的研究發現，

DAB2IP

基因突變會顯著增加肺癌的發病風險。2017年，Sears和Gray的研究發現，抑制DAB2IP的活性會明顯增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。Sun等的研究表明，DAB2IP可以通過激活細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/ERK2信號通路抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力。但目前很少有學者探討DAB2IP在BCC中的作用，袁紹萍等在研究BCC組織時發現，DAB2IP在BCC患者BCC組織中表達下調，提示

DAB2IP

可能在BCC中發揮抑癌基因的作用。但目前關于DAB2IP抑制BCC進展的具體機制尚不明確。本研究采用RT-PCR法檢測BCC組織和正常組織中

DAB2IP

mRNA的相對表達量，Western blot法檢測DAB2IP、caspase 8蛋白的相對表達量，結果發現，BCC組織中

DAB2IP

mRNA的相對表達量明顯低于正常皮膚組織，DAB2IP、caspase 8蛋白的相對表達量均明顯低于正常皮膚組織，提示DAB2IP、caspase 8可能具有抑制BCC的作用。caspase 8是一種經典的細胞凋亡調節因子，在細胞凋亡信號轉導中發揮重要作用。caspase 8作為細胞內特殊的環境感受器，在多種腫瘤組織中表達下調，可通過激活細胞內一系列的信號通路，調控細胞凋亡。Yan等的研究發現，促進caspase 8蛋白在胃癌細胞中的表達可以顯著抑制胃癌細胞的生長。Yang等的研究證實，miRNA-376a可以通過靶向caspase 8促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲。由此可見，caspase 8可能具有廣泛的抗腫瘤作用。Kong等的研究發現，DAB2IP可以通過促進caspase 8的表達來抑制膀胱癌細胞的增殖，并增強膀胱癌細胞對放療的敏感性。本研究通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制BCC細胞中

DAB2IP

基因的表達，通過Western blot法檢測細胞中caspase 8的相對表達量，結果發現，caspase 8的表達同樣被抑制，表明DAB2IP可能通過調控caspase 8的表達抑制BCC細胞的生長。

此外，本研究還分析了DAB2IP、caspase 8表達與BCC患者臨床特征間的關系，結果發現，腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中DAB2IP、caspase 8蛋白相對表達量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，提示DAB2IP、caspase 8可能參與調控了BCC細胞的生長和侵襲過程。

綜上所述，DAB2IP、caspase 8在BCC組織中低表達，DAB2IP可能通過促進caspase 8的表達發揮抗腫瘤作用，靶向DAB2IP有望成為BCC新的治療方案。